Probiotic composition based on the enterococcus strain and used as a treatment means and method for the production thereof



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103. WO2004108905 - 16.12.2004
HYGIENIC CONSOLIDATION OF A MULTI-CHAMBER DOSING SPRAY TECHNIQUE AND THE PROBIOTIC USE THEREOF FOR THE APPLICATION OF VIABLE MICRO-ORGANISMS

URL EPO = http://v3.espacenet.com/textdoc?F=3&CY=ep&LG=en&IDX=WO2004108905


Inventor(s): THENN WILLY (DE); LAUER ECKHARD (DE)
Applicant(s): THENN WILLY (DE); LAUER ECKHARD (DE)
IP Class 4 Digits: C12N
IP Class: C12N1/00
Application Number: WO2004DE01108 (20040527)
Priority Number: DE20031025404 (20030605)
Family: WO2004108905
Equivalent: DE10325404
Cited Document(s): US4874707; US4518696; GB1449606; DE2852779
Abstract:

THE INVENTION RELATES TO A LYOPHILISATE BY WHICH MEANS THE VIABILITY AND ACTIVITY OF THE MICRO-ORGANISMS TO BE USED PROBIOTICALLY IS SECURED DURING THE PERIOD OF USE DUE TO THE SPECIFIC COMPOSITION OF THE SUSPENSION MEDIUM. SAID SUSPENSION MEDIUM CONTAINS AT LEAST ONE AMINO ACID AND/OR PEPTIDIC CONSTITUENT, ESPECIALLY PEPTONE, IN A QUANTITY OF UP TO 0.2 % (M/V) IN RELATION TO THE ENTIRE NITROGEN CONTENT OF THE SUSPENSION MEDIUM. THE INVENTIVE TWIN-CHAMBER DOSING DISPENSING SYSTEM ENSURES A HYGIENIC SPRAY DOSING OF THE SUSPENSION, WITHOUT PRESERVATIVES, BEFORE AND DURING THE PERIOD OF USE.Description:

Hygienische Sicherung der Mehrkammerdosiersprьhtechnik und deren probiotsche Anwendung zur Applikation lebensfдhiger Mikroorganismen Probiotische Mittel ["Probiotics"von pro (lat.) und bios (griech. ) soviel wie "nьtzlich fьr das Leben"] sind nach Fuller (J. Appl. Bacteriol. 66,365- 378,1989) solche, die spezielle Mikroorganismen, z. B. als Nahrungs- supplement, enthalten und den Zweck haben, die intestinale, physiologische Ba- lance im Darm bzw. dessen mikrobiologisches Цkosystem, die"Biofilmbesied- lung"auf den Schleimhдuten, gesundheitlich zu unterstьtzen. Heutzutage wird diese Definition sogar nicht nur auf den Darm, sondern sinngemдss und im weite- ren Sinn auf die Biofilmbesiedlungen der Haut oder der Schleimhaut (Mund, Ra- chen, Nase, Vagina) bezogen. Im Darm sind gesundheitlich positive Effekte me- tabolisch und/oder immunologisch messbar und werden wissenschaftlich katego- risiert als"mikrobiell assoziierte Charakteristiken (MAC) " (Luckey : Am, J. Clin.
Nutr. 30,1753-1761, 1977 ; Midtvedt et al. : J. Ped. Gastroenterol. Nutr. 7, 559-567,1988 ; Fuller, Cole : Chapter 1 in : Probiotics-Theory and Applications.
Stark, Wilkinson (eds. ), Chalcombe Publ., 1989). Diese"symbiotischen"Bezie- hungen zwischen Wirt und Bakterienbesiedlung sind lebenslang wesentlich fьr die Gesundheit und fьr die Lebensfдhigkeit in normaler Umwelt ьberhaupt.
Probiotische Produkte, z. B. Joghurt mit Zusatz spezieller Kulturen, sind lange bekannt und wurden erfolgreich auch schon vor Bekanntwerden des unspezifi- zierten Begriffs"probiotisch"vermarktet. Auch Medikamente, die spezielle, le- bensfдhige Kulturen und/oder deren Bestandteile und Stoffwechselprodukte als Wirkstoffe enthalten, wurden entwickelt (Mackowiak : Am. J. Med. 67,293- 306,1979 ; Salminen, von Wright : Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker, Inc. Ba- sel, 1993). Die heute vorrangig als"Nahrungssupplement"vermarkteten Milch- produkte basieren meistens auf flьssiger Mediumgrundlage, Medikamente dage-

gen auf gefriergetrockneten Kulturen, dosiert in Tabletten oder Kapseln. Die Anwendung solcher probiotischen Kulturen erfolgt also entweder in frisch kulti- vierter, sozusagen Joghurt-дhnlicher, flьssiger oder in gefrier-, sprьh-oder wir- belschichtgetrockneter Form. Die direkte Auftragung von Mikroorganismen mit- tels"Kontaminationssprьhnebel"auf die Haut oder Schleimhaut ist nur selten versucht worden, denn diese Anwendungsform birgt noch zu viele Probleme und Risiken, wie weiter unten nдher ausgefьhrt wird.


Fьr Darmzubereitungen werden bisher ausschliesslich als apathogen bezeichnete Bakterien, meist Milchsдurebakterien mit der niedrigsten Erregerrisikoeinstufung genutzt, wie Laktobazillen, Laktokokken, Enterokokken oder Bifidobakterien, aber auch apathogene Hefen, z. B."Saccharomyces boulardii". Eine wissen- schaftlich und klinisch fundierte Begrьndung fьr solche Wirkstoffe ist nur selten gegeben (Hooper et al. : Ann. Rev. Nutr. 22,283-307, 2002 ; Mercenier et al. : Curr. Pharmaceut. Design 9,175-191, 2003). Die"ratio"zwischen Anwen- dungszweck und Art bzw. Eigenschaften der verwendeten Mikroorganismen ist meist vage begrьndet.
Statt probiotischer Komponenten kommen alternativ oder in"synbiotischer" Kombination mit diesen auch"prebiotische"Stoffe zum Einsatz. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die die metabolische Aktivitдt einer Biofilmbesiedlung indirekt fцrdern sollen. Lange bekannt ist z. B. die Anwendung von Lactulose, ein Zucker, der nicht im menschlichen Dьnndarm absorbiert, wohl aber durch Biofilm-Bakterien metabolisiert werden kann und somit deren Aktivitдt fцrdert (Fuller, Cole, 1989). Dadurch wird der Ammoniak-Spiegel im Blut bei Leberzir- rhose-Patienten gesenkt.
Aufgrund der beschrдnkten Kenntnis der komplexen, physiologischen Interaktio- nen von Wirtsorgan und Biofilmgemeinschaft, war die Anwendung lebensfдhiger Bakterien als Wirkstoffe bisher praktisch nur zur oralen oder vaginalen Applikati- on entwickelt. Dabei hatte zunдchst eine Unterscheidung von Wirkstoffen in flьssiger oder getrockneter Form keine primдre Bedeutung, allenfalls eine der

qualitativen Art. So sind flьssige Kulturen i. d. R. von labiler Qualitдt, anders als gefriergetrocknete Prдparationen. Umgekehrt ist ein Nachteil der trockenen Aus- bringung die eventuell ungleichmдssige Verteilung des Wirkstoffs auf der Schleimhaut, wodurch ein gьnstiger Effekt erheblich limitiert sein kann. Eine Anwendung auf empfindlichen Schleimhдuten, wie des Rachens, der Nase, der Bronchien oder im Augenbereich wдre so ьberhaupt nicht zu verwirklichen.


Zur Ausweitung der Anwendungsmцglichkeiten bestand also die Aufgabe, ein System zu haben, das die Vorteile der flьssigen und getrockneten Form des kul- turellen Wirkstoffs vereint und somit auch kritischere Anwendungen erlaubt.
Dies wдre z. B. mit einem Dosierspray erreichbar, dessen Dosierflьssigkeit, nach Suspendieren eines Trockenkulturpulvers mit einem Flьssigmedium kurz vor Anwendung, eine fein dosierbare, homogene Suspension ist. Dies und einige Dosiergerдte sind dem Fachmann durchaus schon bekannt, und dieser kennt auch das inhдrente Problem dieser Technik, nдmlich das Risiko der hygienischen Instabilitдt von flьssigen Zubereitungen, die hдufig auftretenden Fremdkontami- nationen wдhrend des Anwendungszeitraums. Aus diesem Grund hat sich prak- tisch fьr Dosiersysteme die Beigabe von Konservierungsmitteln in der Suspensi- on als unabdingbar eingebьrgert. Dies schьtzt den Patienten vor einem mцgli- chen Infektionsrisiko und den Dosiersysteminhalt vor dem Verderb. Viele Kon- servierungsmittel haben leider besondere Probleme : allergische oder toxische Reaktionen beim Patienten, kurze Ьberlebensraten des probiotischen Wirkstoffs und immer noch weiter bestehende hygienische Risiken durch Kontamination mit resistenten Keimen.
Zur Vermeidung von Konservierungsstoffen bei Dosiersystemen sollten folgende Voraussetzungen erfьllt sein : (i) Der Inhalt sollte durch einen entsprechend prд- zise gearbeiteten Verschluss vor Kontamination dauerhaft geschьtzt sein. (ii) Der beim Sprьhstoss entstehende Unterdruck sollte so ausgeglichen werden, dass keine kontaminierte Luft in die Zubereitung gelangt. (iii) Auch im Bereich des Auslassventils, durch das die Zubereitung abgegeben wird, sollten in Flьssig-

keitsresten-weder durch eingesaugte, kontaminierte Luft noch durch Diffusion von aussen-Kontaminationen auftreten.


Fьr die probiotische Anwendung sind die bisherigen Systeme nicht hinreichend sicher. Immerhin benutzen manche Systeme Silber zum Schutz des Inhalts vor Verkeimung.
Es ist bekannt, dass Silber im Kontakt mit Wasser geringe Mengen an Silber- lonen (Ag+) bildet, die allgemein antibakteriell wirken, was als oligo-dynamischer Effekt bezeichnet wird.
Erfindungsgemдss ist ein Lyophilisat mit lebensfдhigen Mikroorganismen, Be- standteilen oder Stoffwechselprodukten derselben vorgesehen, das in Form ei- ner Suspension in einem aktivitдtserhaltenden und konservierenden Medium vor- liegt und als Wirkstoff zur aktiven Beeinflussung oder Generierung mikrobieller Biofilmgesellschaften auf Menschen, Tiere oder Pflanzen oder Organe derselben mit Hilfe eines Dosiersprьhnebels in gleichmдssiger Verteilung aufsprьhbar ist.
Weiter ist vorgesehen, dass es sich bei den Mikroorganismen um Bakterien oder deren Bestandteile oder Stoffwechselprodukte handelt. Bevorzugt handelt es sich bei den Bakterien um probiotische Bakterien, insbesondere Milchsдurebakte- rien.
Das Lyophilisat ist als Wirkstoff zur metabolisch positiven Aktivierung menschli- cher, tierischer oder pflanzlicher Organe verwendbar.
Erfindungsgemдss enthдlt das aktivitдtserhaltende und konservierende Medium eine oder mehrere Aminosдuren und/oder peptidische Bestandteile, insbesondere Pepton. Dabei ist weiter vorgesehen, dass es die Aminosдure (n) und/oder pepti- dischen Bestandteile in einer Menge von bis zu 0,2% (m/v), bevorzugt 0,01 bis 0,2% (m/v), bezogen auf den Gesamtstickstoffgehalt des Suspensionsmediums, enthдlt.

Die Erfindung sieht demnach ein Medium vor, das so wirkt, dass die probiotische Flьssigzubereitung nicht nur vor Fremdkontamination, sondern auch vor Inaktivierung wirksam geschьtzt ist. Die Effizienz ist nachweisbar anhand der stabilen Aktivitдt und Lebensfдhigkeit der probiotischen Bakterien und der gleichzeitig bestehenden hygienischen Stabilitдt der Suspension wдhrend des Anwendungszeitraums. Die Besonderheit der Erfindung liegt darin, dass sich die gesteuerte Passivierung von Ag+ im Gemisch durch den Gehalt von Aminosдuren oder am einfachsten-weil Anminosдuren kostspielig sind bzw. weil ohnehin ein unspezifisches Gemisch von Aminosдuren und Peptiden genьgt-durch bestimmten Gehalt von Pepton im Medium ersetzen lдsst, obwohl gerade solche Bestandteile eher zur Vermehrung von Mikroorgamismen, also auch zur Fцrderung von Kontaminanten, geeignet sind.


Pepton, ein Gemisch aus freien Aminosдuren und Oligopeptiden, ist fьr auxotroph wachsende Bakterien, insbesondere fьr Milchsдure bildende Bakterien, z.
B. der Acidophilus-Artengruppe, ein wesentlicher Kulturbestandteil. Pepton aus pflanzlichen Ausgangsmaterialien wie Soyabohnen oder aus tierischen Materialien wie Milch, Fleisch oder Leber erwiesen sich als vielseitig geeignet. Pepton wird z. B. durch kontrollierte enzymatische Proteolyse mit Pepsin unter sauren Bedingungen gewonnen. Die so erhaltene, aufgereinigte, sprьhgetrocknete Substanz ist ein feines, hellbraunes und hygroskopisches Pulver mit charakteristischem, jedoch nicht fauligem Geruch, ist in Wasser gut lцslich, unlцslich in Ethanol und Ether. Folgende chemisch-physikalischen Spezifikationen werden gemдss Peptic Digest of Animal Tissue USP zur Qualitдtscharakterisierung geprьft : Grad des proteolytischen Abbaus, ggf. auch Rest an coagulierbarem Eiweiss, Gehalt an Gesamtstickstoff und Aminostickstoff, Trocknungsverlust, Sulfatasche-Menge, Nitritgehalt, pH-Wert der wдssrigen Lцsung und bakteriologisch-kulturelle Parameter. Je nach Ausgangsmaterial oder Herstellungsart sind erhebliche Toleranzen zu beachten : Gesamtstickstoff (Kjeldahl), 5-15 % m/m bzw. Aminostickstoff (betreffend Aminosдuren und Peptide), 1-6 % m/m ; Sulfatasche, 2-15 % m/m ; pH-Wert in 2%-iger Lцsung : pH 6-8. Anlage 1 zeigt die

durchschnittliche Aminosдure-Zusammensetzung verschiedener Peptone (Angaben nach Merck AG, Darmstadt).


Spezifizierte Angaben fьr unsere Versuche.
Ein hoher Gesamtstickstoffgehalt von > 10 % m/m und Aminostickstoff von > 2 % m/m sind ein gutes Mass fьr unsere Zwecke, wobei dies prinzipiell keine Anforderung fьr einen bestimmten Gehalt individueller Aminosдuren voraussetzt. Denn es ist bekannt, dass zur Stabilisierung der Vermehrungs-und Lebensfдhigkeit von Bakterien in wдssriger Suspension das Vorliegen eines"Gesamt-Pools" von bis zu 20 Aminosдuren notwendig ist. Ausserdem ist die kontrollierte Passivierung von Silber-lonen im Medium ebenfalls unabhдngig von der Zusammensetzung bezьglich individueller Aminosдuren. Jedoch zeigten unsere Versuche, dass der Gehalt an Aminosдuren zur Passivierung beachtet werden muss, da eine direkte Korrelation besteht. Zum Beispiel weist das experimentell verwendete Pepton Oxoid L34 einen Gesamtstickstoffgehalt von ca. 14 % m/m auf, d. h. auf Medium A (zu starke Passivierung) mit 1 % Pepton/Lцsung kommen 0,14 % m/m, auf Medium B (zielgerechte Passivierung) mit 0,1 % Pepton/Lцsung kommen 0,014 % m/m, und auf Medium C (hцhere Passivierung als in Medium B) mit 0,5 % Pepton/Lцsung kommen 0,07 % m/m Gesamtstickstoff allein aus Pepton ; der Anteil Aminosдuren aus Hefe-Extrakt kann bei diesen Medien vernachlдssigt werden, da er nur geringe Mengen an freien Aminosдuren betrдgt. Somit ergibt sich eine auf Gesamtstickstoff basierte Toleranz von 0,014-0, 14 % fьr zielge- rechte Passivierung von Ag'in Medium.
Zum gleichen Zweck-was wir nicht getestet haben-kцnnen selbstverstдnd- lich auch andere Aminogruppen enthaltende Verbindungen anstelle von Aminosдuren verwendet werden, z. B. Ammoniumsalze, organische Ammoniumverbindungen, Guanido-oder Guanidino-Strukturen, Guanin-, Adenin-, Thymin-und Cytosin-basierte Strukturen, die in Medien fьr bakteriologische Zwecke verwendet werden. Derartige Verbindungen sind i. d. R. ohnehin in Pepton enthalten,

wenn auch in substantiell vergleichsweise viel geringerer Konzentration als Aminosдuren.


Als probiotische Bakterien zur Anwendung beim Menschen oder Tier kommen vorrangig Milchsдurebakterien unterschiedlichster Art zur Anwendung, wie sie in der allgemeinen Literatur, z. B. Section 14 und 15 von Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 2, Sneath et al., Williams & Wilkins, London 1986), beschrieben sind. Als Beispiel fьr unsere Versuche dienten Stдmme von Lactobacillus gasseri (Section 14) und Bifidobacterium longum (Section 15), z. B. B. longum ATCC 15707.
Analog ist auch eine Sprьhdosierung mit nicht lebensfдhigen Bestandteilen zur Anwendung vorgesehen, z. B. mit Gram-negativen Bakteriengruppen, wie sie in Vol. 1 von Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Krieg und Holt (eds. ), Williams & Wilkins, London 1984) beschrieben sind, z. B. Acinetobacter calcoa- ceticus ATCC 23055 (Section 4).
Analog ist auch eine Sprьhdosierung mit lebensfдhigen Bakterien an Pflanzen vorgesehen, z. B. mit Stickstoff-fixierenden Bakterien, etwa Azotobacter-Arten (Section 4), etwa Azotobacter chroococcum ATCC 480.
Analog ist eine Sprьhdosierung von Pflanzen gegen Schadinsekten vorgesehen mit Bakterien der Gattungen Sporolactobacillus oder Bacillus (Section 13 in Vol.
2 von Bergey's Manual of Systematic Bacteriology), z. B. Bac. thuringiensis ATCC 10792.
Zielgerichtete Effekte der Erfindung.
Wirkweisen der erfindungsgemдssen Suspension von lebensfдhigen Bakterien in Medium bzw. des Mediums allein sind :

der Pepton-bzw. Aminosдuregehalt des Mediums passiviert Ag'ist so weit fixiert bzw. als Mediumbestartdteil minimiert, dass die Entwicklung unerwьnschter Keime gehemmt ist, wдhrend probiotische Bakterien ausreichend lange in lebens-und vermehrungsfдhigem Zustand verblei- ben das Vermischen des zunдchst sterilen Mediums in der unteren Kammer des Mehrkammer-systems mit dem Kontaminanten-arm (= Fremdkeim- arm) hergestellten Lyophilisat, enthaltend die probiotische Kultur, aus der oberen Kammer bedingt einen metastabilen Hygienezustand, der je- doch a) durch die besondere Zusammensetzung des Mediums allein schon ein Ьberwuchern mit Kontaminaten verhindert und b) gleichzeitig die Lebensfдhigkeit der probiotischen Kultur ausreichend stabil erhдlt etwa in die Kultursuspension wдhrend der Anwendungsphase aus der

Aussprьhцffnung gelangte Ag+ hemmen die Aktivitдt der probiotischen

Keime nicht, tragen dennoch zur Hemmung der Entwicklung fremder

Keime bei die probiotischen Mikroorganismen ьben von sich aus (auch ohne Ag+) einen Effekt gegen eine Kontaminationsentwicklung in der Suspension aus Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Zweikammer-Dosierspray- System vorgesehen, das eine chemische Konservierung aufgrund des"oligody- namischen Effekts"von Silber (Ag) erьbrigt. Bei dem erfindungsgemдssen Do- siersystem befindet sich ein Silberfaden direkt im Sprьhdosierkopf der Dosier- pumpe, so dass von aussen eingedrungene Fremdkeime durch den Kontakt mit Ag+ rasch inaktiviert und dadurch der flьssige Systeminhalt vor Kontamination geschьtzt werden. Anstelle eines Silberfadens kann auch eine Silberbeschich- tung entlang der Austrittsbahn der Suspension vorgesehen sein. Silber kann zu- dem auch durch ein anderes oligodynamisch wirksames Metall ersetzt sein. Die Konstruktion des Mehrkammersystems garantierte zudem eine ausreichende Iso-

lation des Kulturlyophilisats gegenьber Feuchte und Luft, indem ausser einer Kammer fьr die Flьssigzubereitung mit dem Medium noch eine abgetrennte Kammer zur Aufnahme des probiotischen Kulturlyophilisats vorhanden ist. Diese Kammer ist mit dem Kulturlyophilisat befьllt, welches erst direkt vor der ersten Anwendung aseptisch mit dem Medium in der Mediumkammer vermischt wird, um so eine frisch zubereitete Kultursuspension zu erzielen. Hierzu wird der Boden der Kammer mittels der in die Funktionsstellung vorgeschobenen AirlessPumpe des Systems geцffnet. Diese Lyophilisatkammer ist absolut vor Luft und Feuchtigkeit von aussen und aus der Mediumkammer geschьtzt, um eine konstante Qualitдt des Kulturlyophilisats und der probiotischen Wirksamkeit auch wдhrend der Lagerhaltung zu gewдhrleisten. Gleichzeitig ist das Risiko von Kontaminationen unterbunden.


Weiter ist vorgesehen, dass die Kammer, die die Suspension aufnimmt, vorteilhaft z. B. durch einen weichen Beutel gebildet ist, der sich bei Abgabe des Kammerinhalts zusammenzieht. Der weiche Innenbeutel befindet sich bevorzugt innerhalb eines weitgehend starren Aussenbehдlters, der Цffnungen zum Eintritt von Luft in den Zwischenraum zwischen Innenbeutel und Aussenbehдlter hat.
Der Sprьhdosierkopf der Dosierpumpe ist bevorzugt so ausgebildet, dass keinerlei Luft von aussen in den Innenbeutel eintreten kann.
Die Ausbildung kann aber auch so getroffen sein, dass die die Suspension aufnehmende Kammer durch einen starren Behдlter gebildet ist, in den nach Abgabe von Flьssigkeit jeweils Luft zum Druckausgleich eintritt, die dabei aber einen geeigneten Filter durchstrцmen muss.
Die Erfindung sieht somit ein Lyophilisat mit lebensfдhigen Mikroorganismen, Bestandteilen oder Stoffwechselprodukten derselben vor, das in Form einer Suspension in einem aktivitдtserhaltenden, revitalisierenden und konservierenden Medium vorliegt, das eine oder mehrere Aminosдuren und/oder peptidische Bestandteile, insbesondere Pepton, enthдlt, wobei die Aminosдure (n) und/oder

peptidischen Bestandteile in einer Menge von bis zu 0,2% (m/v) bezogen auf den Gesamtstickstoffgehalt des Suspensionsmediums enthalten sind.


Demnach sieht die Erfindung eine stabile Suspension von Mikroorganismen, insbesondere Milchsдurebakterien, vor, mit dem Effekt der vollen Revitalisierung und Aktivitдtserhaltung aus einem bevorzugt gefriergetrockneten Zustand bei gleichzeitiger Sicherung des hygienischen Reinheitszustands der Suspension.
Die Erfindung sieht ferner ein Zweikammer-Dosierabgabesystem, insbesondere Spraysystem, vor, mit einer ersten Kammer, die in einem Ausgangszustand eine Suspensionsflьssigkeit enthдlt, einer zweiten Kammer, die in einem Ausgangzustand ein in trockener Form vorliegendes Kulturlyophilisat enthдlt und luftdicht verschlossen ist, und mit einer Dosierpumpe, wobei vor Ingebrauchnahme des Systems die zweite Kammer zur ersten Kammer hin geцffnet wird, so dass das Kulturlyophilisat in die Suspensionsflьssigkeit gelangt, wobei die Suspensionsflьssigkeit ein aktivitдtserhaltendes und konservierendes Medium ist, das eine oder mehrere Aminosдuren und/oder peptidische Bestandteile, insbesondere Pepton enthдlt, und wobei die Aminosдure (n) und/oder peptidischen Bestandteile in einer Menge bis zu 0,2% (m/v) bezogen auf den Gesamtstickstoffgehalt des Suspensionsmediums enthalten sind.
Das erfindungsgemдsse Zweikammer-Dosierabgabesystem gewдhrleistet eine hygienische Spraydosierung der Suspension ohne Konservierungsmittel vor und wдhrend des Anwendungszeitraums.
In den folgenden Versuchen wird das Verhalten unterschiedlicher Bakterien in von uns entwickelten Suspensionsmedien unterschiedlicher Zusammensetzung vergleichend dargestellt und der Passivierungsfaktor veranschaulicht. Dem Fachmann gelдufig ist die Herstellung von Medien, die Handhabung der Kulturen, die Feststellung des aktiven Zustands einer Kultur anhand der Prьfung des Koloniebildungsvermцgens der Testkeime auf geeigneten Spezial-medien. Ausser unserer probiotischen Kultur wurden auch solche Kontaminationskeime getestet,

die der Fachmann zur Prьfung auf ausreichende Konservierung einsetzt (Bagel, Wiedemann : DAZ 139,4438-4441, 1999). Zusдtzlich wurden diese Testkeime mit und ohne Beimischung unserer probiotischen Kultur, also auch im Kulturmisch, untersucht sowie zum Vergleich das Verhalten in unterschiedlich zusammengesetzten Medien.


Experimente. a) Zusammensetzung und Herstellung der Suspensionsmedien :

Tabelle 1 : Tabellarische Darstellung der Zusammensetzung der Suspensions- medien.

Substanz *) Zusammensetzung des Mediums (g/Liter) :

(bzw. Bedingung) : Medium A Medium B Medium C Medium D Medium E

Fleischpepton 10 1 5 0 0

Hefeextrakt 1 0 0,5 0 0

Natriumacetat 3 3 3 0 0

Natriumchlorid 5 4 5 0 8

Magnesiumsulfat 0,2 0 0 0 0

Kaliumphosphat 0,8 1 0,8 0 0

Natriumascorbat 0 0 0 8 0

Ascorbinsдure 0 0 0,8 0 1

Tween 80 0, 2 0,2 0,2 0,2 0,2

pH-Wert : 6,0 5,9 4,8 6,5 3,1

*) Nдheres, s. Text. Als Substanzen kommen ьblicherweise auf dem Markt verfьgbare Materialien zum Einsatz, etwa Fleischpepton Oxoid L 34, Hefeextrakt Oxoid L 21, Na-

Acetat Merck Art. 6265, Na-Chlorid Merck Art. 6400, Mg-Sulfat Merck Art.


5882, Kaliumdihydrogensulfat Merck Art. 104873, Tween 80 Merck Art.
822187, Na-Ascorbat Merck Art. 500076, Ascorbinsдure Merck Art.
500074. Die Substanzen werden in entionisiertem Wasser (destilliertem Was- ser) zu 1000 ml gelцst und der pH-Wert mit einem pH-Messgerдt geprьft. Die

Verteilung der Medien zu 15 ml in sterile Proben-bzw. Dosierspraybehдltnisse


erfolgt aseptisch bei gleich-zeitiger Sterilfiltration mittels Membranfiltration (Membran : Nitrocellulose/50 mm Durchmesser/0, 2 Mikrometer Porenwei- te/steril) oder ggf. durch Verteilen nach Autoklavieren des Mediums bei

121 C fьr 15 min. b) Art und Stammbezeichnung der Testorganismen :

Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphy- lococcus aureus ATCC 6538P, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404, Lactobacillus gasseri ATCC 33323. As probiotische Test- kultur dient z. B. ein Stamm L. gasseri H 18b, beispielsweise als gefrierge- trocknete Prдparation mit mind. 10"KBE/g in einem Stoffgemisch aus Bakteri- en, Kulturbestandteilen, Zuckern, Gelatine und Ascorbat und mit einer max.


Restfeuchte von 2 %. Der Einfluss solcher Zusдtze muss grundsдtzlich bei der

Passivierung von Ag+ auch berьcksichtigt werden. Wenn ihr Anteil im fertig suspendierten Stoffgemisch allerdings-wie hier in unserem Fall-ver- gleichsweise minimal ist, kann dies i. d. R. vernachlдssigt werden ; in unserem

Testgemisch zeigte sich kein Effekt. c) Kulturbedingungen :

Die Kulturbedingungen und Standardmedien fьr die Testorganismen bzw. die

Prьfung auf ausreichende Konservierung sind in der USP und im Europдischen

Arzneibuch (PharmEur) beschrieben. Zur Kultivierung von L, gasseri wurde

MRS-Medium (de Man et al., 1960 : p. 1216 in Section 14, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2. Sneath et al. (eds. ), Williams & Wilkins,

London 1986) und Blutagar (nach Hackenthal & Bierkowski, 1951 ; modifiziert nach Lerche und Reuter : Zbi. Bakt. I. Abt. Orig. 182,324-356, 1961) ver- wendet ; Bebrьtungstemperatur : 37 C. Das Wachstum von L. gasseri nach *

Ausplattieren auf MRS-Agar erfordert ein sauerstoff-armes Gasgemisch, wozu

handelsьbliche Anaerobiersysteme von Oxoid GmbH (Wesel, D) oder Merck

KgaA (Darmstdt, D) hinreichend geeignet sind. d) Keimzahlbestimmung und Aktivitдtsmessung :

Die Keimzahlen werden wie ьblich ьber Koloniezдhlung (Kolonie bildende Ein- heiten = KBE) ermittelt und in Zehnerpotenzen wiedergegeben. Eine Aktivitдt von 100% ist definiert als die Keimzahl, die zu Beginn der Testung vorliegt.


Die Abnahme von 2 Zehnerpotenzen kommt also einer Restaktivitдt von 1% gleich. Eine solche Abnahme innerhalb einer definierten Frist von beispiels- weise 28 Tagen (d) gilt fьr mikrobiologische Massstдbe als akzeptabel. Eine signifikante Unterschreitung ist erst bei Abnahme um 3 Zehnerpotenzen (0, 1 % Restaktivitдt) gegeben. Fьr die Prьfung auf ausreichende Konservie- rung ist dagegen die rasche Inaktivierung der Testkeime innerhalb von weni- gen Tagen eine wichtige Anforderung. Dem Fachmann ist gelдufig, dass Ver- mehrung und Inaktivierung exponentiellen Raten entsprechen. Daher wird nachfolgend die Aktivitдt stets in Zehnerpotenzen dargestellt. e) Durchfьhrung der Experimente :

Die Experimente wurden mit folgender Fragestellung durchgefьhrt :

1. Wie verhдlt sich die Aktivitдt der Testorganismen im jeweiligen Suspensi- onsmedium wдhrend 28 d bei Raumtemperatur.
2. Wie verhдlt sich die Aktivitдt der Testorganismen im jeweiligen Suspensi- onsmedium in Gegenwart von oligodynamisch wirkendem Ag+ wдhrend

28 d bei Raumtemperatur.


3. Wie verhдlt sich die Aktivitдt der Testorganismen im jeweiligen Suspensi- onsmedium im Gemisch mit probiotischer Kultur L, gasseri wдhrend 28 d bei Raumtemperatur.
4. Wie verhдlt sich die Aktivitдt der Testorganismen im jeweiligen Suspensi- onsmedium in Gegenwart von oligodynamisch wirkendem Ag+ und im
Gemisch mit probiotischer Kultur L. gasseri wдhrend 28 d bei Raumtem- peratur.
Die jeweiligen 100%-Aktivitдten (Start-Keimzahlen) sind in den Tabellen zu den Ergebnissen angegeben. Alle Testansдtzen wurden jeweils von unbeimpf- ten Kontrollen begleitet.
Ergebnisse.
Suspensionsmedium A : Die Ergebnisse zu 1. und 2. (siehe e) zeigt die Tabelle 2.
Tabelle 2 : Die Aktivitдt der Testkeime im Suspensionsmedium A mit und ohne Ag+ wдh- rend 28 d bei Raumtemperatur (20-25 C).

Testkultur Aktivitдt (KBE/ml) bei Probenahme (d)

0 d 0, 25 d 1 d 7 d 14 d 28 d

Kontrolle-Ag * steril n. t. *) n. t. n. t. n. t. steril

+ Ag+ steril n. t. n. t. n. t. n. t. steril

E. coli-Ag+ 1, 2 x 106 1,1 x10'7, 4x10' 6, 0x10" 5, 8 x 106 7, 6 x 107

+ Ag+ 1,0 # 106 8,2 # 105 2,6 # 104 5,0 # 107 6,4 # 106 2, 8 # 105

Ps. aerug. - Ag+ 1,8 # 106 1,6 # 106 5,0 # 106 1,0 # 109 6,0 # 106 8,6 # 106

+ Ag+ 2, 0 x 106 1, 0 x 106 4, 4 x 105 7, 8 x 106 3, 6 x 105 1, 0 x 106

St. aureus-Ag+ 4, 4 # 105 5, 0 x 105 1, 7 # 108 7,9 # 108 4,4 # 106 7, 8 x 10'

+ Ag+ 4,6 # 105 8,2 # 105 1,0 # 106 9, 6 # 104 3,4 # 103 4, 8 x 103

C. albicans - Ag+ 1,1 # 106 4,2 # 105 1,2 # 107 3,7 # 107 7,0 # 104 3,2 # 105

+ Ag+ 6, 8 x 10"3, 8 x 10'4, 2 x 106 2, 5 # 107 2,4 # 105 1,4 # 105

A. niger-Ag+ 5,4 x 106 4, 0 # 107 1,2 # 107 Mycel* *) Mycel Mycel

+ Ag+ 1, 5 # 108 1,4 # 108 7,4 # 106 Mycel Mycel Mycel

L. gasseri-Ag+ 6, 0 x 106 n. t. 4, 6 x 105 3, 8 x 106 2,2 x 105 7, 4 x 105

+ Ag+ 6, 0 x 106 n. t. n. t. 3, 0 # 106 1, 2 # 105 9,1 x 104

*) n. t. : nicht getestet ; **) Mycelbildung aufgrund Zellzunahme, d. h. keine Hemmung.


Aus der Tabelle 2 ist zu entnehmen, dass in Medium A der oligodynamische Effekt von Ag+ aufgehoben ist. Das bedeutet, Medium A ist fьr eine Konservie-

rung mittels Ag+ ungeeignet. Die gleiche Versuchsreihe unter Verwendung von Medium A, dem zusдtzlich probiotischer L. gasseri in einer Menge von ca. 106 KBE/ml zugesetzt war (gemдss 3. und 4. unter e), zeigte ebenfalls keinerlei konservierenden Effekt durch Ag+ (Ergebnisse nicht dargestellt).


Suspensionsmedium B : Die Ergebnisse zu 1. und 2. (siehe e) zeigt die Tabelle 3.
Tabelle 3 : Die Aktivitдt der Testkeime im Suspensionsmedium B mit und ohne Ag+ wдh- rend 28 d bei Raumtemperatur (20-25 C).

Testkultur Aktivitдt (KBE/ml) bei Probenahme (d)

0 d 0, 25 d 1 d 7 d 14 d 28 d

I < ontrolle-Ag+ steril n. t. *) n. t. n. t. n. t. steril

+ Ag+ steril n. t. n. t. n. t. n. t. steril

E. coli-Ag+ 5, 6 x 106 6, 2 x 106 7, 2 # 106 2,1 x10'1, 1 x10'2, 3x10"

+ Ag+ 2, 4 x 106 9, 0 x 105 5, 4 x 105 < 20 < 20 < 20

St. aureus - Ag+ 4,4 # 106 3,8 # 106 8,0 # 105 1,6 # 106 2,2 # 109 7,6 # 107

+ Ag+ 6, 0 x 106 4, 8 x 106 2, 7 x 105 4, 6 x 102 < 20 < 20

*) n. t. : nicht getestet ; Wie die Tabelle 3 zeigt, ist im Medium B in Gegenwart von Ag+ ein deutlicher oligodynamischer Effekt schon nach 1 d festzustellen (nur ein Teil der Testkeime geprьft). Die eigentliche Frage-stellung war jedoch, ob und weiche Konservie- rungseigenschaften in Gegenwart von probiotischem L. gasseri zu beobachten sein wьrden (3. und 4. unter e). Dieses Ergebnis ist wie folgt aus Tabelle 4 zu entnehmen.

Tabelle 4 : Die Aktivitдt der Testkeime im Suspensionsmedium B mit und ohne Ag+ und in Gegenwart von probiotischem L. gasseri (ca. 106 KBE/ml) wдhrend 28 d bei 20- 25 C.

Testkultur Aktivitдt (KBE/ml) bei Probenahme (d)

0 d 0, 25 d 1 d 7 d 14 d 28 d

Kontrolle-Ag+ steril n. t. *) n. t. n. t. n. t. steril

+ Ag+ steril n. t. n. t. n. t. n. t. steril

E. coli-Ag+ 4, 8 x 106 2, 8 x 105 3, 6 x 104 5, 0 x 103 < 20 < 20

+ Ag+ 3, 8 # 106 3, 4 x 105 4, 4 # 102 < 20 < 20 < 20

Ps. aerug. - Ag+ 6, 4 x 106 3, 6 x 104 2, 8 x 105 7, 2 x 104 < 20 < 20

+Ag+ 6, 2 x 106 7, 0 x 104 1,. 8 x 102 < 20 < 20 < 20

St. aureus Ag+ 5, 6 x 106 1, 3 x 106 6, 4 x 105 1, 8 x 105 4, 6 x 103 < 20

+ Ag+ 7, 8 x 106 4, 2 x 104 5, 0 # 102 < 20 < 20 < 20

C. albicans-Ag+ 2, 8 # 106 4,4 # 106 5,8 # 106 2,4 # 105 1, 8 x 103 < 20

+ Ag+ 2, 4 x 106 6, 4 x 106 7, 6 x 105 3, 2 # 106 2,8 # 105 7,6 # 103

A. niger-Ag+ 2, 4 x 106 1, 4 x 10'3, 0 x 106 6, 2 x 105 5, 8 x 104 2, 8 x 103

+ Ag+ 1, 2 x 10'7, 8 x 106 3, 2 x 105 1, 4 x 105 4, 2 # 105 2, 4 x 103

L. gasseri-Ag+ 2,4 x 106 2, 4 x 10'2, 4 x 106 1,2 # 106 4, 8 x 105 4, 6 x 104

+ Ag+ 3,2 # 106 2,8 # 106 3,2 # 105 < 20 < 20 < 20

*) n. t. : nicht getestet ; Ьberraschend zeigen die Aktivitдten in Tabelle 4 ein unerwartetes sicheres Kon- servierungsver-halten auch schon ohne Ag+, wдhrend umgekehrt die Aktivitдt der probiotischen Kultur nicht wesentlich geschwдcht wird. Eine starke Ab- schwдchung erfдhrt diese erst in Gegenwart von Ag+ (siehe Tabelle). Da im Do- siersystem jedoch der Silberfaden nicht im Gemisch (wie hier unter Testbedin- gungen) sondern im Auslassventil untergebracht ist, ist die oligodynamische Ak- tivitдtsminderung von L. gasseri nur in diesem Teil des Systems und nicht im Suspensions-gemisch vorhanden.


Die konservierenden Eigenschaften des Suspensionsmediums, enthaltend probio- tischen L. gasseri, ьbt also einen selbstkonservierenden Effekt aus, wobei die Aktivitдt von L. gasseri selbst bis zu 4 Wochen erhalten bleibt und so lange fьr Sprьhstцsse genutzt werden kann.

Suspensionsmedium C : Zum Vergleich mit Medium B testeten wir ein weiteres Medium, das jedoch durch einen 5mal hцheren Pepton-Gehalt gekennzeichnet war. Wir wollten zunдchst wissen, wie die selbstkon-servierende Wirkung, also in Abwesenheit von Ag+, davon beeinflusst wird.


Tabelle 5 : Die Aktivitдt der Testkeime im Suspensionsmedium C mit und ohne Ag+ wдh- rend 28 d bei Raumtemperatur (20-25 C).

Testkultur Aktivitдt (KBE/ml) bei Probenahme (d)

0 d 0, 25 d 1 d 7 d 14 d 28 d

Kontrolle-Ag + steril n. t. *) n. t. n. t. n. t. steril

E. coli - Ag+ 1,0 # 105 n.t. 4,0 # 102 < 20 < 20 < 20

St. aureus - Ag+ 1,0 # 105 n.t. 5,4 # 104 < 20 < 20 < 20

*) n. t. : nicht getestet ; Wie die Tabelle 5 zeigt, ist im Medium C tatsдchlich eine bemerkenswert und ьberraschend starke, selbstkonservierende Wirksamkeit zu beobachten. Es war daher besonders interessant zu prьfen, was fьr eine Aktivitдt L. gasseri und weichen Effekt Ag+ zeigen wьrden. Das Ergebnis dieser Testung zeigt Tabelle 6.

Tabelle 6 : Die Aktivitдt der Testkeime im Suspensionsmedium C mit und ohne Ag+ und in Gegenwart von probiotischem L. gasseri (ca. 106 KBE/ml) wдhrend 28 d bei 20- 25 C.

Testkultur Aktivitдt (I < BE/ml) bei Probenahme (d)

(enthдlt L. gasseri) O d 0,25 d 1 d 7 d 14 d 28 d

Kontrolle - Ag+ steril n. t. *) n. t. n. t. n. t. steril

+ Ag+ steril n. t. n. t. n. t. n. t. steril

E, coli-Ag+ 9, 0 x 105 3, 8 x 105 2, 8 x 104 < 20 < 20 < 20

+ Ag+ 1,1 # 106 8, 4 # 104 3, 4 x 103 < 20 < 20 < 20

Ps. aerug.-Ag+ 1, 6 x 105 7, 2 x 105 4, 4 x 104 < 20 < 20 < 20

+ Ag+ 2,8 # 106 5,0 # 103 < 20 < 20 < 20 < 20

St. aureus-Ag+ 1, 2 x 106 5, 6 # 105 1,3 # 106 4, 6 x 105 3, 0 x 103 < 20

+ Ag+ 1, 9 # 106 2, 4 x 106 7, 0 x 106 2, 2 x 103 < 20 < 20

C. albicans - Ag+ 1,1 # 107 4,2 # 106 1,6 # 107 2,8 # 107 1,6 # 105 4, 6 x 105

+ Ag+ 1,2 # 107 6,8 # 106 9,4 # 106 2,0 # 107 3,8 # 106 2, 4 x 105

A. niger-Ag+ 2, 8 x 10'3, 8 x 10'2, 4 x 105 1, 8 x 104 5, 8 x 104 < 20

+ Ag+ 3, 4 # 105 4,0 # 105 1,8 # 104 2,2 # 105 4, 2 x 103 < 20

L. gasseri-Ag+ 2, 4 x 106 2, 8 x 106 1, 6 # 106 1, 7 x 106 7, 0 x 105 < 20

+ Ag+ 3,4 3 106 2,8 # 106 1,8 # 106 2,8 # 105 < 20 < 20

*) n. t. : nicht getestet ; Auch Medium C weist дhnlich Medium B schon ohne Ag+ einen interessanten aktivitдtssenkenden Effekt auf. Im Vergleich mit Medium B ist aber der oligody- namische Effekt von Ag+, z. B. bei Staphylococcus aureus und bei Lactobacillus gasseri, erheblich vermindert-also einesteils ein ungьnstiger und andernteils gьnstiger Effekt. Im Medium C, das 5mal mehr Pepton als Medium B enthдlt (siehe Tabelle 1), ist der oligodynamische Effekt leicht passiviert, jedoch nicht so vollstдndig wie in Medium A, das 10mal mehr Pepton enthдlt (vgl. Tabelle 3).
Es ist somit offensichtlich, dass die oligodynamische Wirksamkeit von Ag+ von der Peptonmenge abhдngt. Wenn dies richtig ist, mьssten die Medien D und E, beide ohne Peptonzusatz, im Vergleichstest mit Medium B einen noch besseren oligodynamischen Effekt von Ag aufweisen. Dies wird im folgenden deutlich.

Suspensionsmedien D und E : Den Einfluss von Ag auf die Testkeime E. coli, St. aureus und L. gasseri zeigt Tabelle 7.


Tabelle7 : Vergleich der Aktivitдt (in log KBE/ml) einiger Testkeime in den Suspensionsme- dien B, D und E mit und ohne Ag bei Raumtemperatur (20-25 C).

Testkultur Aktivitдt (log KBE/ml) bei Probenahme (d) und Medium

Od 0, 25d 1 d 7d

B D E B D E B D E B D E

Kontrolle-Ag+ st*) st st n. t. *) n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. st st st

+ Ag+ st st st n. t. n. t n. t. n. t. n. t. n. t. st st st

E. coli-Ag+ 6,75 6,58 6,03 5,0 4,86 4,76 6,86 3, 51-*) 7, 33

+ Ag+ 6, 38 6,41 6,15 5,95 4,58 4,48 5, 73--

St. aureus-Ag+ 6, 64 6,06 5,72 6,58 3,64 3,62 5,90 2, 26-6, 30

+Ag+ 6,78 6,70 4,72 6,68 3,73 3,48 5, 43 2, 66

L gasseri-Ag+ 6,70 6,68 6,62 6,80 6,58-6, 60 6, 36-6, 0 5, 80

+ Ag+ n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t.


*) Abkьrzungen und Symbole : n. t. : nicht getestet ; st : steril ;- : keine Aktivitдt mehr.
Die Ergebnisse in der Tabelle 7 sind nicht in Zehnerpotenzen sondern als dekadi- scher Logarithmus angegeben (die erste Ziffer entspricht numerisch der Zehner- potenz). Die hier gezeigten Daten sind im Einklang mit der Annahme, dass der oligodynamische Effekt von Ag+ tatsдchlich um so hцher ist, je weniger Pepton im Medium, und dass die Testkeime in den Medien D und E auch ohne Ag+ schon rasch inaktiv werden. Allerdings hat das gдnzliche Fehlen von Pepton auch negative Auswirkung, denn die Aktivitдt von L. gasseri wird ebenfalls rasch vermindert (so dass sich eine Testung von Ag+ im Gemisch erьbrigte).
Aus den Ergebnissen lдsst sich zusammenfassend sagen, dass ьberraschend ein Medium gefunden wurde, dass, angewendet in einem Dosierspray-System, zwar einerseits eine konservierende Wirkung gegen Verkeimung des Mediums besitzt, andererseits aber die Aktivitдt von im Gemisch enthaltenen probiotischen Milch- sдurebakterien, zum Zweck des Sprьhens auf die Haut oder Schleimhaut, aus- reichend schьtzt.
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Anlage 1Claims:

Patentansprьche 1. Lyophilisat mit lebensfдhigen Mikroorganismen, Bestandteilen oder Stoff- wechselprodukten derselben, das in Form einer Suspension in einem akti- vitдtserhaltenden und konservierenden Medium vorliegt, das eine oder mehrere Aminosдuren und/oder peptidische Bestandteile, insbesondere

Pepton, enthдlt, wobei die Aminosдure (n) und/oder peptidischen Bestand- teile in einer Menge bis zu 0,2% (m/v) bezogen auf den Gesamtstickstoff- gehalt des Suspensionsmediums enthalten sind.
2. Lyophilisat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Mikroorganismen um Bakte- rien oder deren Bestandteile oder Stoffwechselprodukte handelt.
3. Lyophilisat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Bakterien um probiotische

Bakterien, insbesondere Milchsдurebakterien, handelt.


4. Lyophilisat nach einem der Ansprьche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff zur aktiven Beeinflussung oder Generierung mikrobieller Biofilmgesellschaften auf Menschen, Tiere oder Pflanzen oder Organe derselben mit Hilfe eines Dosiersprьhnebels in gleichmдssiger Verteilung aufsprьhbar ist.
5. Zweikammer-Dosierabgabesystem, insbesondere Spraysystem mit einer ersten Kammer, die in einem Ausgangszustand eine Suspensionsflьssig- keit enthдlt, einer zweiten Kammer, die in einem Ausgangzustand ein in trockener Form vorliegendes Kulturlyophilisat enthдlt und luftdicht ver- schlossen ist, und mit einer Dosierpumpe, wobei vor Ingebrauchnahme des Systems die zweite Kammer zur ersten Kammer hin geцffnet wird, so dass das Kulturlyophilisat in die Suspensionsflьssigkeit gelangt, wobei die Suspensionsflьssigkeit ein aktivitдtserhaltendes und konservierendes Me-

dium ist, das eine oder mehrere Aminosдuren und/oder peptidische Be- standteile, insbesondere Pepton enthдlt, und wobei die Aminosдure (n) und/oder peptidischen Bestandteile in einer Menge bis zu 0,2% (m/v) be- zogen auf den Gesamtstickstoffgehalt des Suspensionsmediums enthalten sind.


6. Zweikammer-Dosierabgabesystem nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Dosierkopf der Dosierpumpe in der

Austrittsbahn der Abgabeflьssigkeit eine Sterilisationseinrichtung ange- ordnet ist, die Silber oder ein anderes oligodynamisch wirksames Metall enthдlt.


7. Zweikammer-Dosierabgabesystem nach wenigstens einem der Ansprьche

5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Kammer durch einen weichen Beu- tel gebildet ist, der sich bei Abgabe des Behдlterinhalts zusammenzieht.


8. Zweikammer-Dosierabgabesystem nach wenigstens einem der Ansprьche

5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosierpumpe eine Airless-Pumpe ist, bei der verhindert ist, dass Umgebungsluft in die erste Kammer eintritt.


9. Zweikammer-Dosierabgabesystem nach wenigstens einem der Ansprьche

5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der die erste Kammer bildende weiche Beu- tel in einem starren Aussenbehдlter angeordnet ist, in dessen Wand we- nigstens ein Loch ausgebildet ist, durch das Luft zum Druckausgleich bei der Abgabe von Behдlterinhalt in den Zwischenraum zwischen dem Au- ssenbehдlter und den weichen Beutel eintritt.


10. Zweikammer-Dosierabgabesystem nach wenigstens einem der Ansprьche

5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Kammer durch einen starren Behдl- ter gebildet ist, in den nach Abgabe von Behдlterinhalt jeweils Luft zum

Druckausgleich eintritt, die dabei eine Filtereinrichtung durchstrцmt.


11. Zweikammer-Dosierabgabesystem nach wenigstens einem der Ansprьche

5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Kammer durch einen rohrfцrmi- gen Einsatz gebildet ist, der in die erste Kammer hineinragt und in den der vordere Endabschnitt der Dosierpumpe eingreift, und dass der Boden der zweiten Kammer dadurch zu цffnen ist, dass die Dosierpumpe in axialer

Richtung der Kammer vorgeschoben wird.

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