Probiotic composition based on the enterococcus strain and used as a treatment means and method for the production thereof



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Les inventeurs ont donc isolй et identifiй la dextranesaccharase de L. mesenteroides NRRL B-1299 productrice des GOS d'intйrкt.
Un procйdй d'ingйnierie reverse mis en oeuvre dans les йtapes b) а e) ci-dessus a permis ensuite de fournir la sйquence nuclйotidique codant l'enzyme et permettant de la produire en quantitй industrielle et le cas йchйant de la modifier, d'en amйliorer ses performances par les techniques а la disposition de l'homme du mйtier. A titre d'exemple, on peut citer la mutagйnиse dirigйe ou alйatoire, ou l'йvolution molйculaire (DNA shuffling) (3).
Un autre aspect de l'invention porte sur une molйcule d'acide nuclйique isolйe codant une enzyme а activitй glycosyltransfйrase apte а former des dextranes ou des oligosides prйsentant des ramifications a (1#2) et comprenant au moins une sйquence codant un domaine de liaison au glucane, et au moins une sйquence nuclйotidique codant un domaine catalytique situй en 3'de la prйcйdente, ladite sйquence codant un domaine catalytique ayant au moins 50 % et de prйfйrence au moins 70 % de similaritй avec la sйquence ID No. 3.
Par similaritй, on entend le fait que, pour un mкme cadre de lecture, un triplet donnй est traduit par le mкme acide aminй. Ce terme

inclut donc les modifications de bases rйsultant de la dйgйnйrescence du code gйnйtique.


Le pourcentage de similaritй est dйterminй en comparant une
sйquence donnйe avec la sйquence de rйfйrence. Lorsque celles-ci sont de longueurs diffйrentes, le pourcentage de similaritй est basй sur le pourcentage de nuclйotides de la sйquence la plus courte similaires а ceux de la sйquence la plus longue.
Le degrй de similaritй peut кtre dйterminй conventionnellement par utilisation de logiciels tels le ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acid Research (1994), 22 : 4673-4680) distribuйs par Julie Thompson (ThompsonEMBL-Heidelberq. DE) et Toby Gibson (Gibsone~EMBL-Heidelberg. DE) du Laboratoire Europйen de Biologie Molйculaire, Meyerhosfstrasse 1, D-69117 Heidelberg, Germany. Ctusta ! W peut aussi кtre chargй а partir de plusieurs sites web incluant IGBMC (Institut de Gйnйtique et de Biologie Molйculaire et Cellulaire, B. P. 163,
67404 Illkirch cedex France ; ftp ://ftp-iqbmc. u-strabq. fr/pub/) et EBI (ftpV/ftp ebi ac. uk/pub/software/) et tous les sites renvoyant а l'institut de Bioinformatique (Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK).
Les acides nuclйiques isolйs selon l'invention peuvent comprendre notamment d'autres sйquences destinйes а amйliorer l'expression et/ou l'activitй de l'enzyme produite.
Il peut s'agir а titre d'exemple : - des sйquences codant une sйquence signal pour leur sйcrйtion ; - une duplication de la sйquence codant le domaine catalytique CD2.
De faзon prйfйrйe, un acide nuclйique isolй selon l'invention comprend :

a) deux sйquences codant des domaines catalytiques ayant au moins 50 %, et de prйfйrence au moins 80 % de similaritй avec la sйquence ID no 3 ; b) une sйquence codant le domaine de liaison au glucane, cette derniиre йtant situйe de prйfйrence entre les deux sйquences en a).


Un acide nuclйique selon l'invention pourra comprendre en outre : - un promoteur, apte а son expression dans une cellule hфte choisie, - une sйquence codant un peptide signal, et/ou - une ou des sйquences variables, cette ou ces sйquence (s) йtant toutes situйes en partie 5'des sйquences codant le ou les domaine (s) catalytique (s).
Un exemple particulier d'un acide nuclйique isolй selon l'invention comprend plus particuliиrement : a) la sйquence ID No. 4, b) une sйquence prйsentant au moins 80 % de similaritй avec la sйquence ! D n 4, ou c) le brin complйmentaire de la sйquence a) ou b), ou d) une sйquence hybridant a), b) ou c).
L'hybridation en d) est rйalisйe en conditions standard, et de prйfйrence en conditions stringentes. Par hybridation en condition stringente, on entend le fait qu'il existe une identitй de sйquences d'au moins 80 % de la sйquence que l'on cherche а hybrider et de prйfйrence une identitй d'au moins 90 % de la sйquence que l'on cherche а hybrider, dans des conditions dйcrites par exemple dans Sambrook et Russel (3eme йdition, 2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).
L'invention porte йgalement sur un gиne codant une dextranesaccharase apte а former au moins 15 % de ramifications a (12). Outre la sйquence codante, le gиne comprend les sйquences permettant l'initiation

de la transcription ainsi que les sйquences permettant l'attachement de l'ARN messager au ribosome (RBS). La sйquence ID No. 5 reprйsente une structure du gиne tel qu'isolй de L. mesenteroides NRRL B-1299.


Les nuclйotides en amont de l'ATG d'initiation de la traduction sont numйrotйs 1 а 232.
On peut identifier l'existence d'une sйquence RBS entre les nuclйotides 218 et 223, ainsi que les sйquences consensus-35 et-10 situйes entre les nuclйotides 82 et 86 (TTGAA), d'une part et 100 et 105 (ATAAAT), d'autre part.
Toute sйquence d'acide nuclйique hybridable avec l'ADN de la sйquence ID No. 4 ou son brin complйmentaire est susceptible de coder une enzyme ayant les propriйtйs et caractйristiques de l'enzyme selon l'invention. Ceci s'applique tant aux sйquences naturelles existant dans d'autres micro-organismes que L. mesenteroides NRRL B-1299 et isolйes de banques gйnomiques de microorganismes, que celles prйparйes par gйnie gйnйtique ou par synthиse chimique.
En particulier, les sйquences en amont de l'ATG d'initiation de
la traduction et nйcessaires а l'expression de la protйine peuvent кtre avantageusement substituйes par des sйquences d'initiation de la transcription et/ou de fixation au ribosome adaptйs au systиme d'expression choisi pour la sйquence codante.
Une sйquence d'acides nuclйiques susceptible de s'hybrider en condition stringente avec l'acide nuclйique isolй selon l'invention comprend йgalement des fragments, des dйrivйs, ou des variants allйliques de la sйquence d'acides nuclйiques selon l'invention qui code une protйine ayant l'activitй enzymatique dйcrite ci-avant. Ainsi, les fragments sont dйfinis comme des fragments de molйcules d'acides nuclйiques suffisamment longs pour coder une protйine ayant conservй son activitй enzymatique. Celle-ci inclut aussi bien des fragments dйpourvus de la sйquence codant le peptide signal responsable de la sйcrйtion de la protйine.

Le terme"dйrivй"signifie sйquence, diffйrente de la sйquence originelle, а une ou plusieurs positions, mais prйsentant un haut degrй de similaritй avec ces sйquences. Dans ce contexte, similaritй signifie une identitй d'au moins 80 % des nuclйotides, et de prйfйrence d'au moins 90 % avec la sйquence originelle. Les modifications dans ce cas portent sur des dйlйtions, substitutions, insertions ou recombinaisons, а partir du moment oщ l'enzyme codйe par ces sйquences homologes prйsentent l'activitй enzymatique des polypeptides selon l'invention.


Les sйquences d'acides nuclйiques selon l'invention telles que dйcrites ci-dessus et qualifiйes de dйrivйs de ces molйcules telles que dйfinies ci-avant, sont gйnйralement des variants exerзant la mкme fonction biologique. Ces variations peuvent кtre des variations naturelles, notamment celles observables d'une espиce а l'autre et rйsultant d'une variabilitй inter espиce ou au contraire кtre introduites par le moyen d'une mutagenиse dirigйe, alйatoire ou par DNA Shuffling (йvolution molйculaire).
De la mкme faзon, font partie de l'invention les acides nuclйiques isolйs codant une glycosyltransfйrase apte а catalyser la synthиse de dextrane ou d'oligosaccharide portant au moins 20 % et de prйfйrence au moins 30 % de ramifications de type a (1-)-2) et obtenus par йvolution molйculaire (DNA shuffling) et comprenant : - une йtape de modification alйatoire d'une des sйquences dйcrites prйcйdemment et, en particulier, des sйquences ID Nos. 3 et 4 et d'йtablissement de variants ; - une йtape d'expression de ces sйquences modifiйes dans une cellule hфte appropriйe, un hфte abritant un variant ; - une йtape de criblage des hфtes exprimant une enzyme apte а former plus de 20 % et de prйfйrence plus de 30 % de liaisons a (1-"2) sur un substrat appropriй et une йtape d'isolement du ou des gиnes amйliorйs.
Un acide nuclйique isolй selon l'invention pourra йgalement comprendre :

a) une sйquence ayant au moins 80 % de similaritй avec la sйquence codant une dextrane-saccharase exprimйe par le plasmide pCRT7 -dsrE dans E. coli dйposй а la CNCM le 15 mars 2001 sous le numйro 1- 2649 (E. coli JM 109 [pCR-T7-dsrD]), ou b) une sйquence complйmentaire de la sйquence en a).


La dйnomination de la souche transformйe par le plasmide recombinant pCR-T7-dsrE et dйposйe а la CNCM est celle indiquйe cidessus entre parenthиses. Cela n'affecte pas le changement de dйnomination du gиne opйrй ultйrieurement au dйpфt de ladite souche pour les raisons йvoquйes supra.
L'invention porte йgalement sur les fragments d'acides nuclйiques tels que dйfinis ci-dessus, hybridables avec la sйquence ID No. 4, et utilisables comme sondes d'hybridation pour la dйtection de sйquences codant des enzymes selon l'invention. Ces fragments peuvent кtre prйparйs par toutes les techniques connues de l'homme du mйtier.
Outre les sondes d'hybridation, des amorces d'amplification font йgalement partie de l'invention. Lesdites amorces sont des fragments hybridables avec la SEQ ID No. 4 ou avec son brin complйmentaire et permettent l'amplification de sйquences spйcifiques codant des dextranesaccharases prйsentes dans un organisme procaryote ou eucaryote, animal ou vйgйtal.
L'utilisation de telles amorces d'amplification permet la mise en oeuvre d'un procйdй d'identification de l'existence йventuelle d'un gиne codant une enzyme apte а catalyser la synthиse de GOS avec des ramifications a (1-2) dans un tel organisme, ledit procйdй faisant йgalement partie de l'invention.
L'invention porte йgalement sur des vecteurs d'expression comprenant un acide nuclйique tel que dйcrit ci-avant, sous le contrфle de sйquence permettant son expression et de prйfйrence son excrйtion dans des cellules procaryotes ou eucaryotes. Par cellules procaryotes, on

choisira de prйfйrence des bactйries choisies dans un groupe comprenant E. coli, les Lactococcus, les Bacillus, les Leuconostoc. Par cellules eucaryotes, on choisira de prйfйrence les eucaryotes choisis dans un groupe contenant les levures, les champignons ou les vйgйtaux.


Le vecteur comprend un promoteur adaptй а l'expression de l'acide nuclйique isolй selon l'invention dans le systиme d'expression choisi.
A titre d'exemple, le promoteur du bactйriophage T7 pourrait кtre avantageusement choisi pour une expression dans E. coli.
L'invention porte йgalement sur les cellules hфtes, procaryotes ou eucaryotes, transformйes par un acide nuclйique selon l'invention de prйfйrence compris dans un vecteur d'expression portant un promoteur, adaptй а une expression dans les cellules hфtes choisies. Les cellules transformйes sont choisies dans le groupe des bactйries а Gram-telle E. coli, ou dans le groupe des bactйries а Gram+ telles Lactococcus, Bacillus, Leuconostoc ou parmi les eucaryotes dans un groupe comprenant les levures ou les champignons, ou les vйgйtaux.
Un exemple particulier d'une cellule transformйe selon l'invention est la souche E. coli hйbergeant un plasmide appelй PCR- T7cfsrE et porteur de la sйquence ID No. 4 sous le contrфle du promoteur du bactйriophage T7 et dйposйe а la CNCM le 15 mars 2001 sous le numйro 1-2649.
La prйsente invention, par ailleurs, porte sur un procйdй de production d'une glycosyltransfйrase apte а former des dextranes ou des oligosides prйsentant au moins 15 % et de prйfйrence au moins 20 % de ramifications de type a (1-2) osidiques et comprenant : a) l'insertion d'un acide nuclйique ou d'un vecteur tel que dйcrit prйcйdemment dans une cellule hфte apte а l'exprimer et de prйfйrence а sйcrйter la glycosyltransfйrase ; b) la caractйrisation de l'activitй enzymatique recherchйe par toutes les mйthodes accessibles а l'homme du mйtier ; c) la purification de l'enzyme а partir d'un extrait cellulaire.

Par mйthode de caractйrisation de l'activitй enzymatique connue de l'homme du mйtier, on comprendra les mйthodes dйcrites dans la littйrature par exemple dans la rйfйrence (2) ainsi que de nouvelles mйthodes susceptibles d'кtre mises au point permettant d'identifier et de discriminer les glucooligosaccharides prйsentant le taux de ramification recherchй.


Il s'agit en fait de tout procйdй de criblage permettant d'identifier la prйsence de ramifications a (1-2) dans un GOS.
A titre d'exemple, seront utilisйes :
- l'HPLC pour lequel la migration des GOS varie en fonction de la nature et le positionnement des ramifications, notamment ceux ayant le lien a (1-2) а l'extrйmitй rйductrice et ceux ayant ce lien sur l'avantdernier glucose, et/ou - la Rйsonance magnйtique nuclйaire (RMN), - l'existence d'une rйaction positive avec des anticorps monoclonaux spйcifiques des liaisons a (1-2) sur l'extrйmitй rйductrice et/ou d'anticorps monoclonaux spйcifiques des liaisons a (1- > 2) sur l'avantdernier glucose du GOS.
L'invention porte йgalement sur un procйdй d'obtention d'une glycosyltransfйrase apte а prйsenter des oligosides ou des dextranes prйsentant un taux de ramification a (1#2) supйrieur а 15 % et de prйfйrence supйrieur а 30 % de la totalitй des liaisons osidiques et comprenant une йtape de modification de la sйquence ID No. 4 par addition, dйlйtion, mutation а partir du moment oщ :
- le cadre de lecture n'est pas modifiй, et - les acides aminйs suivants sont conservйs aprиs traduction :

W en positions 425 ou 2122, codй par le triplet TGG en positions 1273 et 6364,

E en positions 430,565, 2127 et 2248 codйs par les triplets GAA en positions 1288,1693, 6379 et 6742 respectivement,
D en positions 487, 489, 527, 638, 2170 et 2210 codйs par les triplets GAT en positions 1459, 1465, 1579, 1912, 6508 et 6628 respectivement,

D en positions 2172 et 2322 codйs par les triplets GAT en positions 6514 et 6964,

H en position 637 et 2321, codйs respectivement par les triplets CAT en position 1909 et CAC en position 6961,

Q en positions 1019 et 2694 codйs respectivement par les triplets CAA (position 3055) et CAG (position 8080).


Un procйdй de production d'une glycosyltransfйrase selon l'invention ayant les mкmes caractйristiques que ci-avant peut йgalement comprendre : - une йtape de modification alйatoire de la sйquence ID no 4 et d'йtablissement d'une banque de variants, - une йtape d'expression de ces sйquences modifiйes dans une cellule hфte appropriйe, un hфte abritant un variant, - une йtape de criblage des hфtes exprimant une enzyme apte а former plus de 15 % et de prйfйrence plus de 30 % de liaison a (1-) 2) sur un substrat appropriй, - une йtape d'isolement du ou des gиnes amйliorйs.
Dans un autre mode de rйalisation de l'invention, le procйdй consiste а modifier la sйquence ID No. 3 par duplication de tout ou partie du domaine catalytique CD2.
On pourra comprendre que les procйdйs ci-dessus visent non seulement а l'obtention d'une glycosyltransfйrase apte а former des oligosides prйsentant un taux de ramification a (1- 2) constant et reproductible, supйrieur а 15 % des ramifications totales mais йgalement а amйliorer le taux de ramification a (1- 2) dans l'objectif de modifier les propriйtйs des oligosides obtenus dans le sens d'une amйlioration de leurs propriйtйs diйtйtiques ou de leur capacitй а maintenir ou rйtablir la flore bactйrienne associйe а certains organes du corps humain ou animal.
La prйsente invention porte enfin sur les glycosyltransfйrases susceptibles d'кtre obtenues par un procйdй citй ci-avant et apte а former au moins 15 % et de prйfйrence au moins 30 % de ramifications de type a (1-"2) osidiques dans des glucooligosaccharides.
L'invention porte enfin sur l'utilisation des glycosyltransfйrases selon l'invention ainsi que celles susceptibles d'кtre obtenues par les procйdйs ci-dessus, dans la fabrication d'une composition а effet prйbiotique ou dans la fabrication d'une composition dermatologique, cosmйtique ou pharmaceutique.
A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer l'amйlioration du transit intestinal chez les animaux et chez l'homme, l'amйlioration de l'assimilation du calcium et/ou du magnйsium et des minйraux en gйnйral, la prйvention du cancer du cфlon, la prйvention ou le traitement des affections de la peau telles l'acnй, les pellicules, les odeurs corporelles.
L'avantage des polypeptides et des acides nuclйiques codant ces polypeptides selon l'invention se situe non seulement au niveau de l'amйlioration en terme de qualitй, de rendement, de reproductibilitй, et de prix de revient des glycosyltransfйrases aptes а former des oligosaccharides avec des ramifications de type a (1---2) osidiques mais йgalement dans la perspective de produire de nouvelles enzymes dont la fonctionnalitй est amйliorйe.
Les figures, exemples et description dйtaillйs ci-aprиs permettent, sans la limiter, d'illustrer les caractйristiques et les fonctionnalitйs particuliиres des polypeptides а activitй enzymatique et des sйquences codant ceux-ci. Elles permettent en particulier d'illustrer de faзon plus prйcise la spйcificitй du domaine catalytique prйsent dans la partie carboxylique de l'enzyme selon l'invention et son йvolution potentielle pour l'obtention d'enzymes amйliorйes.

LEGENDE DES FIGURES : Fiqure 1 : structure des glycosyltransfйrases natives et des protйines recombinantes dйrivйes : la figure 1a) reprйsente la structure des glycosyltransfйrases et des dextrane-saccharases dйcrites dans la littйrature (1). PS : peptide signal ; ZV : rйgion variable, CD : domaine catalytique, GBD : domaine de liaison au glucane. La figure 1 b) reprйsente la structure de la glycosyltransfйrase selon l'invention. Les figures 1c) а 1i) reprйsentent diffйrentes constructions comportant des dйlйtions en comparaison de la protйine DSR-E native. A (PS) correspond au contrфle constituй par la forme entiиre clonйe dans le systиme pBAD-TOPO Thiofusion (Invitrogen).


Fiqure 2 : schйma rйcapitulatif de la mйthode de clonage de la sйquence nuclйotidique codant une glycosyltransfйrase selon l'invention а l'aide d'une bibliothиque gйnomique en utilisant une sonde PCR dйcrite dans le tableau 1 et une sonde Hindltl/EcoRV respectivement.
Fiqure 3 : comparaison des sйquences signal de diffйrentes glycosyltransfйrases de L. mesenteroides. Les acides aminйs conservйs sont en gras. DSR-B : L. mesenteroides NRRL B-1299 (4) ; DSR-S : L. mesenteroides NRRL B-512F (5) ; ASR : L. mesenteroides NRRL B-1355 (6).
Figure 4 : alignement des 11 sйquences rйpйtйes de l'enzyme DSR-E et observйes dans la zone variable.
Figur 5 : alignement des sйquences conservйes du domaine catalytique.
-Bloc A : acides aminйs essentiels de la partie N-terminale du domaine catalytique ; - Bloc B : acides aminйs de la partie du domaine catalytique de liaison au saccharose ; - Blocs C, D, E : blocs contenant les trois rйsidus d'acides aminйs impliquйs dans la triade catalytique (6) ;

- Bloc F : sйquence contenant la glutamin 937 de GTF-I йtudiйe par Monchois et al. (7).


Les acides aminйs entiиrement conservйs sont indiquйs en gras. *) : substitutions conservatives ; : : substitutions semiconservative GAP. Les numйrotations sont celles de la sйquence ID No. 2.
Figure 6 : caractйrisation HPLC des produits synthйtisйs par l'enzyme recombinante DSR-E.
6A : analyse en HPLC des glucooligosaccharides obtenus avec les dextrane-saccharases de L. mesenteroides NRRL B-1299.
6B : analyse HPLC des glucooligosaccharides obtenus par la DSR-E recombinante. L'identification des diffйrents pics suivants :

1 : fructose,

2 : maltose,

3 : sucrose,

4 : panose,

5 : R4,


6 : OD4,

7 : R5,


8 : OD5,

A, B, C : pics non identifiйs.


6C : DSR-E recombinante dйlйtйe du domaine catalytique de la partie carboxylique de l'enzyme (A DSR-E).
Fiqure 7 : analyse HPLC des produits de la rйaction d'accepteur sur maltose, synthйtisйs par les diffйrentes formes entiиres et dйlйtйes de la protйine DSR-E.
L. m. B-1299 : mйlange de dextrane-saccharases produit par L. mesenteroides NRRL B-1299.
L'identification des diffйrents pics se fait comme suit :

F : fructose

M : maltose

S : saccharose P : panose

R4, R5 : GOS comportant des liaisons a (1#2)

OD4, OD5 : GOS dйpourvus de liaisons a (1#2).


MATERIELS ET METHODES :

1) Souches bactйriennes, plasmides et conditions de croissance :

Toutes les souches sont conservйes а-80 C dans des tubes contenant 15% de glycйrol (v/v).
Leuconostoc mesenteroides B-1299 (NRRL, Peoria, USA) est cultivйe а 27 C, sous agitation (200 RPM) sur milieu standard (saccharose 40 g. l-1, phosphate potassium 20 g. r1, extrait de levure 20 g. l-1, MgSO4-
7H2O 0. 2 g. r, MnSO4-H2O 0. 01g. r\ NaCI 0. 01g. r1, CaCb 0. 02 g. l~1, FeSO4-7H2O 0.01 g. !'), le pH йtant ajustй а 6,9.
Escherichia coli DH5a et JM109 ont йtй cultivйes sur milieu LB (Luria-Bertani).
La sйlection des clones recombinants de pUC18 ou pGEM-T Easy est effectuйe sur boites LB-agar supplйmentй avec 100 ug. ml' d'ampicilline, 0.5 mM d'isopropyl-ss-D-thiogalactopyranoside (IPTG) et 40 g. ml'1 de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-galactopyranoside (X-gal). Des cellules d'E. coli TOP 10 ont йtй utilisйes pour le systиme de clonage de produit PCR TOPO Cloning (Invitrogen), et cultivйes sur milieu LB supplйmentй de kanamycine а la concentration de 50 ug. ml-1.
En ce qui concerne l'expression de dsrE, le kit de clonage ECHO Cloning System (Invitrogen) permet le clonage d'un produit PCR dans un vecteur donneur (pUNIN5-His-TOPO), prйcйdant une йtape de recombinaison avec un vecteur accepteur adaptй (pCR-T7-E). Ce systиme requiert des cellules E. coli PYR1, TOP 10 et BL21 (DE3) pLysS cultivйes sur milieu LB supplйmentй de 50 g.ml-1 de kanamycine, ainsi que de 34 g. ml'1 de chloramphйnicol pour la souche BL21 (DE3) pLysS.

Les plasmides pUC18 digйrйs et dйphosphorylйs proviennent de Pharmacia (Amersham Pharmacia Biotech) et ont йtй utilisйs pour la constitution de banque d'ADN gйnomique de L. mesenteroides NRRL B- 1299. Le clonage de produit PCR a, quant а lui, nйcessitй l'emploi de plasmide pGEM-T Easy (Promega), et pour les fragments de plus de 2 kbp, de plasmide TOPO-XL (Invitrogen).


Le systиme pBAD-TOPO Thiofusion (Invitrogen), utilisй pour construire les diffйrentes formes dйlйtйes de la protйine DSR-E, met en jeu le promoteur araBAD, dont les mйcanismes de contrфle impliquent la protйine rйgulatrice AraC. En l'absence d'inducteur, а savoir le L-arabinose, la protйine dimйrique AraC s'associe aux structures rйgulatrices de l'opйron et entraоne la formation d'une boucle d'ADN, ladite boucle bloquant ainsi la transcription des gиnes placйs sous le contrфle du promoteur araBAD. En prйsence de L-arabinose en revanche, AraC forme un complexe, ce qui libиre la boucle d'ADN et permet l'initiation de la transcription. L'expression basale peut кtre limitйe en ajoutant du glucose au milieu de culture : celui-
ci intervient en diminuant le niveau d'AMP cyclique, et donc l'activation concomitante de la protйine CAP (cAMP activator protein). Le niveau d'activation obtenu est fonction de la concentration en L-arabinose, de telle sorte que les conditions optimales de production de la protйine d'intйrкt peuvent кtre sйlectionnйes avec prйcision.
De plus, l'emploi de ce vecteur permet de positionner une
йtiquette thioredoxine de 12 kDa du cфtй N-terminal de la protйine d'intйrкt. Cette fusion vise а favoriser la traduction du gиne codant ladite protйine d'intйrкt. La protйine йtiquette permet en outre d'augmenter la solubilitй de la protйine а laquelle elle se trouve fusionnйe. Le systиme pBAD-TOPO Thiofusion est conзu pour permettre d'йliminer facilement l'йtiquette thioredoxine, par simple clivage а l'aide de l'entйrokinase. Enfin, grвce а ce systиme d'expression, une йtiquette histidine est insйrйe du cotй de l'extrйmitй C-terminale de la protйine d'intйrкt. Une telle йtiquette est utile pour purifier ladite protйine par affinitй.
Dans le cadre de l'utilisation de ce systиme, la souche E. coli TOP 10 a йtй cultivйe sur milieu LB supplйmentй de 100 ug. ml' d'ampicilline.
2) Electrophorиse sur qel, localisation et caractйrisation de l'enzyme :

Aprиs une culture de L. mesenteroides NRRL B-1299 de 7h, le milieu a йtй centrifugй (7000 RPM, 4 C, 30 min) et les cellules, oщ 90% de l'activitй enzymatique se retrouve, ont йtй concentrйes 10 fois dans une


solution de tampon acйtate (20 mM, pH 5, 4), chauffйes 5 minutes а 95 C en prйsence de solution de dйnaturation (Tris HCI 62. 5 mM, SDS 4%, urйe 6M, bleu de bromophenol 0. 01% et ss-mercaptoethanol 200 mM). 300 ul du mйlange a йtй dйposй sur gel de polyacrylamide а 7%. Aprиs migration, les protйines totales ont йtй rйvйlйes par coloration au noir amido, alors que l'activitй dextrane-saccharase a йtй dйtectйe par coloration du polymиre au rйactif de Schiff aprиs synthиse de dextrane in situ. Les bandes correspondant а des dextrane-saccharases actives ont йtй excisйes et incubйes sйparйment dans 2 ml de solution d'acйtate de sodium 20 mM pH
5. 4 contenant 1009. 1-1 de saccharose et 50 g.)' de maltose. Aprиs consommation totale du saccharose, la rйaction a йtй arrкtйe par chauffage а 95 C pendant 5 minutes, et le milieu rйactionnel centrifugй 5 minutes а 15000g afin d'йliminer le dextrane insoluble. Les йchantillons ont йtй analysйs par chromatographie en phase inverse (colonne C18, Ultrasep 100,6 um, 5x300mm, Bishoff Chromatography) en utilisant de l'eau ultrapure comme йluant, а un dйbit constant de 0.5 ml. min-1. Les oligosaccharides ont йtй sйparйs pendant 30 minutes а tempйrature ambiante, et dйtectйs par rйfractomйtrie. Le sйquenзage peptidique a йtй rйalisй sur les bandes protйiques sйlectionnйes par le Laboratoire de Microsйquenзage, Institut Pasteur, Paris.
3) Techniques de biologie molйculaire utilisйes :

La purification du plasmide de E. coli et la purification de l'ADN gйnomique de L. mesenteroides ont йtй rйalisйes en utilisation

respectivement QiaPrep Spin Plasmid kit et le Cell Culture DNA maxi kit (QiaGen). Les procйdйs d'amplification et de clonage ont йtй rйalisйs en utilisant les techniques standard (Sambrook et Russel, 2001, supra). Les enzymes de restriction et de modification, provenant des sociйtйs commerciales New England Biolabs ou Gibco BRL, ont йtй utilisйes selon les protocoles des fabricants.
La PCR a йtй rйalisйe avec des amorces choisies sur la base de la sйquence protйique obtenue sur une bande de gel d'йlectrophorиse isolйe (voir supra, йlectrophorиse sur gel et localisation de l'enzyme). Deux peptides ont йtй sйlectionnйs : - 29-FYFESGK, et - 24-FESQNNNP et utilisйs pour synthйtiser des oligonuclйotides dйgйnйrйs et indiquйs dans le tableau 1 ci-dessous.
Dans ce tableau oщ les numйrotations sont celles de la sйquence ID no. 4, il apparaоt que la prйsence d'un rйsidu sйrine dans les deux peptides nйcessite la synthиse de deux amorces pour chaque peptide dans la mesure oщ la sйrine peut кtre codйe par six codons diffйrents.
ECHO-dir et ECHO-inv sont les amorces utilisйes ayant permis l'amplification de dsrE par PCR pour son clonage dans le systиme d'expression ECHO Cloning (Invitrogen).

TABLEAU :


Dйsignation Description Sйquence 5'-3' 29-dir1FYFESGK TT (C/T) TA (C/T) TT (C/T) GA (A/G) TCAGG (C/G) AA (A/G) 29-dir2 TT (Cfr) T A (Crr) TT (CIT) GA (A/G) AGCGG (C/G) AA (A/G) 24-Inv1 FESQNNNP (T IG) GG (GIA) TT (G/A) TT (G/A) TTTTG7'GA (T/C) TCAAA 24-inv2 (T/G) GG (G/A) TT (G/A) TT (G/A) TTTTGGCT (T/C) TCAAA IPCR-rev sйquence nt CCCTTTACAAGCTGATTTTGCTTATCTGCG 5769-5798 IPCR-dir sйquence nt GGGTCAAATCCTTACTATACATTGTCACACGG 8311-8342 ECHO-dir sйquence nt-6-AGTTGTATGAGAGACATGAGGGTAATTTGTGACCGTAAAAAATTG 39 ECHO-anv sйquence nt ATTTGAGGTAATGTTGATTTATCACCATCAAGCTTGAAATATTGACC 8457-8504

PCR : La PCR a йtй rйalisйe en utilisant un thermocycleur Perkin- Elmer, modиle 2400, et avec 50 nanogrammes d'ADN gйnomique. Les quantitйs d'amorces utilisйes йtaient de 10 uM de 29-Dir1 et de 24-lnv1. Au mйlange rйactionnel, ont йtй ajoutйs 250 uM de chaque dйsoxynuclйotide triphosphate, et la Taq Polymйrase.


Aprиs une amplification de 25 cycles а 94 C pendant 30 secondes puis а 500 C pendant 30 secondes, puis а 72 C pendant 5 minutes, un fragment de 666 paires de base a йtй obtenu.
Certains fragments ont йtй amplifiйs а l'aide du systиme Expand Long Templat PCR (Roche Boehringer Mannheim), conformйment aux indications d'utilisation du fournisseur. Ce systиme permet d'amplifier des fragments de grande taille, jusqu'а environ 20 kbp, de maniиre trиs efficace. La combinaison de deux ADN polymйrases permet notamment de minimiser le taux d'erreur durant les йtapes d'йlongation.
Hybridation southern et bibliothиque gйnomique de L. mesenteroides NRRL B-1299 :

L'ADN chromosomique de L. mesenteroides NRRL B-1299 a йtй digйrй avec diffйrentes enzymes de restriction, puis sйparй par йlectrophorиse sur gel d'agarose а 0,8 % en tampon TAE 0,5X.


Des bibliothиques gйnomiques de la bactйrie ont йtй transfйrйes sur des membranes de nylon hybond N+ (Amersham PharmaciaBiotech). L'hybridation a йtй rйalisйe en utilisant le fragment de 666 paires de bases а la dйsoxy-adйnosine-triphosphate marquй au 32p. La rйaction de marquage a йtй rйalisйe en utilisant le kit de marquage"Mega Prime DNA Labelling System Kit" (Amersham PharmaciaBiotech), suivie par la purification de la sonde sur des colonnes MicroSpin S-200HR. La prй-hybridation et l'hybridation ont йtй rйalisйes en conditions fortement stringentes (650 C pendant la nuit, selon les mйthodes habituelles) (Sambrook et Russel, 2001, supra).

PCR inverse : La rйaction de PCR inverse permet d'obtenir un fragment d'ADN linйaire а partir d'une matrice circulaire en utilisant des amorces divergentes.


L'ADN gйnomique de L. mesenteroides NRRL B-1299 a йtй digйrй par EcoRV dans les conditions recommandйes par le fournisseur.
Aprиs re-circularisation, les produits de digestion ont йtй utilisйs comme matrice dans une rйaction de PCR inverse [Extrapolll DNA polymerase (Eurobio), volume rйactionnel de 50 ! JI, paramиtres de la rйaction de PCR inverse : 25 cycles ; 94 C, 30 secondes ; 510 C, 30 secondes ; 720 C, 3 minutes]. Les deux amorces ont йtй choisies en fonction de la sйquence de l'insert de pSB2 comme indiquй dans la figure 2.
La figure 2 rйsume les modalitйs d'obtention des diffйrents plasmides porteurs des fragments de dsrE par criblage de la bibliothиque gйnomique et utilisation des sondes dйcrites ci-dessus.
Sйquence d'ADN et analyse :

Aprиs le sйquenзage des peptides, des amorces dйgйnйrйes dessinйes en tenant compte de la frйquence d'utilisation des codons dans les gиnes de dextrane-saccharases de L. mesenteroides NRRL B-1299, ont йtй synthйtisйes et ont permis l'amplification d'un fragment de 666 bp.


Le sйquenзage de ce fragment a rйvйlй de fortes homologes avec les gиnes de dextrane-saccharases dйjа connus, tout en йtant totalement nouveau.
L'utilisation de ce fragment comme sonde homologe dans des expйriences de Southern, a permis de repйrer des signaux positifs sur diffйrentes pistes d'ADN gйnomique digйrй. Une premiиre banque Hindlll a ainsi йtй criblйe, et un plasmide recombinant, nommй pSB2, contenant un insert de 5,6 kbp, a йtй purifiй. L'analyse de la sйquence de ce fragment Hindlll a rйvйlй un cadre ouvert de lecture couvrant la totalitй de l'insert. Ensuite, une banque EcoRV a йtй criblйe avec une sonde Hindlil/EcoRV

isolйe а l'extrйmitй N-terminale de l'insert Hindlll de 5, 6 kbp. Un plasmide recombinant pSB3, testй positivement par dot-blot, s'est avйrй contenir un insert de 3,8 kbp qui, aprиs sйquenзage, a йtй montrй contenir le codon d'initiation de la traduction et la rйgion promotrice du nouveau gиne de dextrane-saccharase nommй dsrE.

Dans le but d'obtenir le codon de terminaison de dsrE, une PCR inverse a йtй rйalisйe sur de l'ADN gйnomique de L. mesenteroides NRRL B-1299 digйrй par EcoRV et religuй sur lui-mкme, en utilisant des amorces oligonuclйotidiques divergentes dessinйes а partir de la sйquence de l'insert pSB2. Un fragment unique а la taille attendue de 1 kbp a йtй amplifiй puis clonй dans un pGEM-T Easy, pour obtenir le plasmide pSB4.
Aprиs sйquenзage, la sйquence amplifiйe situйe en aval du site Hindlll comporte 221 bp et contient le codon de terminaison du cadre de lecture de dsrE, situй 30 bp en aval du site de restriction Hindili.
Le sйquenзage des diffйrents fragments portйs par les trois plasmides a йtй rйalisй par la sociйtй Gйnome Express et ce, sur les deux brins. Les analyses des sйquences de nuclйotides ont йtй rйalisйes en
utilisant le"ORF Finder" (http ://www. ncbi. nlm. nih. qov/oorf/aorf html), Blast qorf/qorf html), Blast (http : //www. ncbi. nlm nih. qov/blast/blastcqi, Altschul et al., 1997) ClustalW (http ://www2. ebi. ac. uk/clustalw, Thompson et al., 1994), PRODOM (http ://protein. toulouse. inra. fr/prodom. html, Corpet et a/., 2000), PFAM (http.//pfam. wustl. edu/hmmsearch. shtml, Bateman et a/., 2000) et SAPS
(http ://bioweb. pasteur. fr/seqanal/interfaces/saps. html, Brendel et al., 1992), l'ensemble de ces logiciels йtant accessible par internet.
Expression de la protйine : Deux systиmes de clonage et d'expression ont йtй utilisйs aux fins de la production de protйines recombinantes chez E. coli, а savoir les systиmes ECHO-Cloning et pBAD-TOPO Thiofusion (Invitrogen).
A titre d'exemple, se trouve briиvement dйcrite ci-aprиs la mйthode de clonage de la sйquence nuclйotidique codant la protйine DSRE au moyen du systиme ECHO-Cloning.

Deux amorces telles que proposйes dans le tableau 1 ci- dessus ont йtй utilisйes dans le cadre de l'amplification а l'aide du systиme "Expand Long Template"dans les conditions suivantes : 94 C pendant 3 minutes suivis de 25 cycles а 940 C pendant 30 secondes, 55 C pendant 30 secondes, et 68 C pendant 7 minutes. Les produits PCR ont ensuite йtй clonйs dans le vecteur pUNIN5-His-TOPO, permettant l'obtention d'un vecteur donneur (pUNI-dsrE) а recombiner avec un vecteur accepteur (pCR-T7-E) et adaptй а l'expression dans E. coli. Le plasmide final a йtй dйsignй pCR-T7-dsrE.


Cette construction, plaзant le gиne dsrE sous le contrфle du promoteur du bactйriophage T7, a permis l'expression inductible du gиne
dsrE.
Aprиs induction avec 1 mM d'IPTG, les cellules de E. coli BL21 transformйes ont йtй rйcoltйes par centrifugation aprиs 4 heures de croissance, et re-suspendues а une densitй optique finale de 80 а 600 nm dans du tampon acйtate de sodium 20 mM pH 5,4 et du Triton X100 а 1% (v/v) en prйsence de 1 mM PMSF afin d'empкcher la protйolyse dans les extraits cellulaires aprиs sonication.
Des expйriences similaires, rйalisйe avec le systиme pBADTOPO Thiofusion, ont permis de construire le vecteur recombinant pBADTOPO-dsrE.
Tests enzymatiques :

Les rйactions enzymatiques ont йtй rйalisйes dans les conditions standard а 30 C dans du tampon acйtate de sodium 20 mM pH


5, 4, NaN3 1 g/t' et saccharose 100 g/r1. L'activitй de l'enzyme DSR-E a йtй dйterminйe en mesurant la vitesse de libйration des sucres rйducteurs, reprйsentйs en l'espиce par le fructose, а l'aide de la mйthode а l'acide dinitro-salicylique bien connue de l'homme du mйtier. Une unitй a йtй dйfinie comme la quantitй d'enzyme qui catalysait la formation d'1 umoi de fructose par minute dans les conditions standard. Les oligosaccharides ont

йtй synthйtisйs dans un milieu rйactionnel contenant 100 g/I de maltose, 200 g/t de saccharose et 0, 5 unitйs/ml de DSR-E.


Comme pour la synthиse de dextrane, la rйaction enzymatique a йtй poursuivie pendant 24 heures en prйsence de 100 g/l de glucose. Le dextrane produit a йtй prйcipitй en prйsence d'йthanol 50 % (v/v) et lavй deux fois dans l'йthanol а 50 % (v/v) avant lyophilisation. Il a ensuite йtй dissous а 10 mg/ml dans du D20 et analysй par spectromйtrie
deRMrl du 13C.
Sйparation par HPLC : Des йchantillons de 100 ! JI ont йtй prйlevйs et chauffйs а 95 C pendant 5 minutes, puis diluйs dans de l'eau ultra-pure de maniиre а obtenir une concentration finale en sucres totaux infйrieure а 5g. r1, Aprиs centrifugation, les substrats rйsiduels et les diffйrentes espиces formйes ont йtй analysйs par HPLC sur colonne C18 (Ultrasep 100, 6 um, 5x300 mm, Bishoff Chromatography).
La sйparation des oligosides a йtй rйalisйe а tempйrature ambiante, pendant 30 minutes, dans de l'eau ultra-pure appliquйe а titre d'йluant а un dйbit de 0,5 ml/min. La dйtection a йtй accomplie par rйfractomйtrie.
De telles conditions ont permis de sйparer les espиces suivantes : fructose, maltose, leucrose, saccharose, ainsi que les oligosides dont le degrй de polymйrisation ne dйpassait pas 6.
Calcul des rendements :

La mйthode de calcul des rendements des rйactions de synthиse d'oligosides a pris en compte la concentration rйsiduelle d'accepteur, conformйment а la formule suivante : R = { [GOS finaux]- [GOS initiaux]}/ {0,474 x saccharose consommй] + [accepteur consommй]} oщ R reprйsente le rendement rйel de la rйaction de synthиse des GOS totaux, les concentrations йtant exprimйes en g/L


Construction des diffйrentes formes dйlйtйes de la protйine DSR-E :

Les diffйrentes formes dйlйtйes de la protйine DSR-E [Figure 1 c) а 1i)] ont йtй obtenues par amplification par PCR des fragments correspondants du gиne dsrE, puis clonage dans le vecteur pBAD-TOPO Thiofusion, dont la description est fournie supra. Les amorces utilisйes pour l'amplification des rйgions sйlectionnйes а partir du gиne dsrE sont listйes dans le tableau Il suivant. Les positions des amorces sont indiquйes en rйfйrence а la sйquence ID no. 5, relative а la sйquence du gиne dsrE. Les bases mutйes afin d'introduire le site de restriction Ncol sont en caractиres gras et le site Ncol rйsultant est soulignй.

TABLEAU Il :
Dйsignation Positions Sйquence 5'-3' pBAD-PS/ZV-dir 344-373 GCCATGGCAAATACGATTGCAGTTGACACG pBAD-ZV/CD1-dir 971-1001 GCCATGGACGGTAAAACCTATTTTCTTGACG pBAD-CD1/GBD-dlr 3656-3682 TCCATGGGTGAAAAAACAAGCACCGGC pBAD-GBD/CD2-dir 6167-6189 ACCATGGATATGTCTACTAATGC pBAD-CD1/GBD-inv 3638-3658 TAACTGTTTAGGCAAGAATCC pBAD-GBD/CD2-lnv 6146-6172 TAATGTATTAGTGAATAAGTATTCACC pBAD-ent-lnv 8714-8737 AATTTGAGGTAATGTTGATTTATC
Les amorces directes et inverses ci-dessus ont йtй dessinйes de maniиre а assurer la fusion traductionnelle de l'йtiquette thioredoxine en N-terminal et l'йtiquette polyhistidine en C-terminal des formes protйiques tronquйes en respectant les cadres ouverts de lecture des rйgions codant lesdites formes.
Dans la mesure oщ le plasmide pBAD-TOPO Thiofusion contient un site de restriction spйcifique de l'enzyme Ncol situй au niveau de l'extrйmitй 5'de la rйgion codant la thioredoxine, un deuxiиme site Ncol

a йtй introduit dans chaque amorce directe afin de pouvoir, le cas йchйant, extraire ladite rйgion.


Les rйactions d'amplification par PCR ont йtй rйalisйes а l'aide du systиme Expand Long Templat dans les conditions suivantes : une prй-dйnaturation а 94 C pendant 3 minutes, suivie de 25 cycles а 94 C pendant 30 secondes, 52 C pendant 30 secondes et 68 C pendant 7 minutes.
Les produits d'amplification ainsi gйnйrйs ont ensuite йtй clonйs dans le vecteur pBAD-TOPO Thiofusion aux fins de la transformation subsйquente de la souche E. coli TOP 10. Des clones recombinants ont йtй sйlectionnйs, leur profil de restriction analysй afin d'identifier, pour chacune des formes recherchйes, un plasmide recombinant portant l'insertion orientйe comme attendu.
Exemple 1 : Caractйrisation et purification de l'enzyme DSR-E et obtention du gиne dsrE

Les enzymes produites par les cultures de L. mesenteroides et obtenues sur gel de polyacrylamide en SDS tel que dйcrit dans la partie Matйriels et Mйthodes ont йtй isolйes par dйcoupe du gel.


Les GOS produits par les enzymes ainsi isolйes ont йtй analysйs par HPLC selon les mйthodes dйcrites dans (1). L'enzyme dont l'activitй йtait recherchйe a йtй dйduite de la nature des GOS produits.
Aprиs protйolyse trypsique et sйparation par HPLC des peptides produits, 2 peptides : 29-FYFESGK et 24-FESQNNNP ont йtй sйquencйs et utilisйs comme modиle pour la synthиse d'amorces nuclйotidiques dйgйnйrйes.
Les diffйrentes йtapes d'amplification et de clonage sont reprйsentйes dans la figure 2. Le gиne complet a йtй insйrй dans le plasmide pCR-T7-E et exprimй dans E. coli.
La production d'une enzyme fonctionnelle est attestйe par la production des GOS dont l'analyse HPLC est reprйsentйe dans la figure 6b).
On remarquera en particulier l'importance des pics 5 et 7 reprйsentatifs des GOS а ramification a (1-2).
Exemple 2 : caractйrisation des sйquences de dsrE et DSR-E

2.1 Sйquence nuclйotidique :

La sйquence nuclйotidique de l'enzyme est reprйsentйe dans la sйquence ID No. 4. Elle est composйe d'un cadre de lecture de 8506 nuclйotides.
La sйquence nuclйotidique de l'insert dans le plasmide pCR- T7 -dsrE contient un site de liaison au ribosome (RBS), 9 bases en amont du codon d'initiation ATG et est composйe d'un hexa-nuclйotide GAGGAA.
2.2 Analyse de la sйquence d'amino-acides :

La sйquence de 8506 nuclйotides de dsrE code une protйine de 2835 acides aminйs reprйsentйe dans la sйquence ID No. 2. Le point isolectrique de cette protйine est de 4,88 et son poids molйculaire thйorique de 313,2 kDa. En dйpit des fortes similaritйs avec les dextranesaccharases dйjа connues, DSR-E est caractйrisйe par une structure original.


L'alignement de la sйquence d'amino-acides avec l'ensemble des glycosyltransfйrases et des dextrane-saccharases connues confirme que la structure en domaine des glycosyltransfйrases et des dextranesaccharases est conservйe, а savoir : une sйquence signal, une rйgion variable, un domaine catalytique hautement conservй et un domaine de liaison au glucane. Cette structure est reprйsentйe dans la figure 1a).
Comme l'indique la figure 1b), un deuxiиme domaine catalytique forme la partie carboxy-terminale de l'enzyme comme cela йtй confirmй par PRODOM et une analyse Blast.
Avec un poids molйculaire de 313,2 kDa, DSR-E a environ 2 fois le poids molйculaire moyen des autres glycosyltransfйrases et dextrane-saccharases (1), ce qui est en accord avec la prйsence d'un

deuxiиme domaine catalytique а l'extrйmitй C-terminale et йgalement avec un domaine de liaison au glucane plus long. a) analvse de la sйquence signal :

La sйquence signal et la sйquence nuclйotidique codant le peptide signal sont extrкmement conservйes si on les compare aux autres dextrane-saccharases comme ceci est indiquй dans la figure 3. Le site de clivage est localisй entre les acides aminйs 40 et 41. b) domaine variable :

En aval du peptide signal, DSR-E a un domaine variable de 207 acides aminйs. Lorsqu'on le compare aux autres domaines variables des glycosyltransfйrases, en utilisant un programme d'alignement de type


SAPS, on met en йvidence la prйsence d'un motif de 14 acides aminйs rйpйtй 11 fois comme ceci est indiquй dans la figure 4.
Ce motif rйpйtй, riche en alanin, threonine et acide aspartique n'a jamais йtй identifiй prйcйdemment.
Le rфle et la signification de cette rйgion n'ont jamais йtй йlucidйs. Diffйrentes йtudes ont dйmontrй que sa dйlйtion n'affecte pas l'activitй enzymatique (4). Le rфle du motif rйpйtй de 14 acides aminйs qui n'existe pas dans les autres glycosyltransfйrases reste nйanmoins а dйterminer. c) analyse des domaines catalytiques :

Le premier domaine catalytique s'йtend des acides aminйs 248 а 1142 (CD1) de la sйquence ID No. 2, alors que le deuxiиme est localisй entre les acides aminйs 1980 et 2836 (CD2). Ces deux domaines prйsentent 45 % d'identitй et 65 % de similaritй entre eux.


CD1 et CD2 contiennent les acides aminйs dйjа identifiйs dans les glycosyltransfйrases et les dextrane-saccharases comme йtant essentiels а leur activitй enzymatique, et comme ceci est indiquй dans la figure 5.
Les triades catalytiques de CD1 et CD2 dйterminйes par analogie avec l'a amylase (7) sont prйsentes aux positions suivantes :

(Asp 527/Glu 565/Asp 638 pour CD1 et Asp 2210/Glu 2248/Asp 2322 pour CD2).


D'autres rйsidus conservйs ont йtй identifiйs comme importants pour l'activitй enzymatique : les rйsidus Trp 425/Glu 430 pour CD1 et Trp 2122/Glu 2127 pour CD2, lesquels sont analogues а celles du domaine N-terminal de GFTI dйcrits par Monchois et al. (4) : Trp 344/Glu 349.
En revanche, certaines sйquences situйes dans la rйgion conservйe des glycosyltransfйrases et des dextrane-saccharases ne se retrouvent pas dans CD2 de DSR-E. Ainsi, comme indiquй dans la figure 5 ci-dessous, les sйquences FIHNDTI (2214-2220) et KGVQEKV (2323- 2329) divergent des autres sйquences consensus des dextranesaccharases dйjа йtudiйes qui sont respectivement NVDADLL et SEVQTVI. d) domaine de liaison au qlucane :

Lorsque l'on compare la sйquence de DSR-E avec les sйquences connues, il apparaоt que le domaine de liaison au glucane est sensiblement plus long. En effet, ce domaine a une longueur d'environ 500 acides aminйs dans les glycosyltransfйrases et les dextranesaccharases йtudiйes alors que dans DSR-E, il reprйsente 836 acides aminйs. Plusieurs motifs rйpйtйs A et C et, en particulier, une sйrie de rйpйtitions AC ont pu кtre identifiйs. Dans le Tableau 111 suivant, sont indiquйes les sйquences consensus des motifs rйpйtйs du GBD, notamment des motifs A et C, dйcrits dans la littйrature relativement а des dextrane-saccharases de Leuconostoc et Streptococcus spp.

TABLEAU II :
Motif Sйquence consensus A WWYFNxDGQAATGLQTIDGQTVFDDNGxQVKG B VNGKTYYFGSDGTAQTQANPKGQTFKDGSGVLRFYNLEGQYVSGSGWY C DGKIYFFDPDSGEWKNRFV D GGWKNADGTYSKY N YYFxAxQGxxxL
x : acide aminй indiffйrent.
Exemple 3 : expression de dsrE chez E. coli

Des cellules de E. coli BL21 (DE3) pLysS pCR-T7-dsrE ont йtй cultivйes comme dйcrit ci-dessus. Aprиs gel d'йlectrophorиse en polyacrylamide- (page-SDS) l'analyse des extraits protйiques a rйvйlй effectivement la prйsence de plusieurs bandes ayant l'activitй de dextrane saccharase, ladite activitй йtant mesurйe comme ci-dessus.


La lignйe E. coli JM109 [pCR-T7-dsrD] a йtй dйposйe а la CNCM le 15 mars 2001 sous le numйro 1-2649.
Identification et caractйrisation de l'activitй enzymatique :

En utilisant une molйcule accepteur de glucose, les dextranesaccharases produites par E. coli recombinant ont йtй comparйes avec celles produites par L. mesenteroides NRRL B-1299.


L'analyse HPLC des produits de la rйaction avec la DSR-E recombinante montre (figure 6) des temps de rйtention correspondant aux GOS prйalablement identifiйs R4 et R5 (2). Les oligosaccharides de type R sont les sйries de GOS linйaires, le lien a (1#2) йtant liй а l'extrйmitй nonrйductrice. La sйrie OD, GOS linйaires rйsultant de liens glycosidiques a (1-6) avec un rйsidu maltose а l'extrйmitй rйductrice, a йtй observйe en trиs faibles quantitйs. Trois nouveaux composйs sont en revanche dйtectйs dans les produits de l'enzyme recombinante.

Identification des GOS produits : Finalement, la figure 6b montre clairement que les pics 5 et 7 reprйsentant les GOS de la sйrie R sont relativement plus importants avec l'enzyme recombinante qu'avec l'enzyme native dont les pics correspondant au panose et а OD5 sont plus importants.

Exemple 4 : Effet de la dйlйtion de CD2 sur l'activitй enzymatique de DSR-E L'ADN gйnomique de L. mesenteroides NRRL B-1299 a йtй utilisй comme matrice pour amplifier par PCR le gиne dsrE dйlйtй de la sйquence correspondant au second domaine catalytique. Pour cela, 2 oligonuclйotides, ECHO-dir (5'-AGTTGTATGAGAGACATGAGGGTAATTTGTGACCGTAAAAAATTG) (SEQ. ID No. 6), correspondant а la sйquence nuclйotidique-6 а 39 et contenant le codon d'initiation de la traduction, et ECHO-inv-dйl (5'- GTATTAGTGAATAAGTATTCACCATTGCATTTATCGTCAAAATAGTACG) (SEQ. ID No. 7) complйmentaire de la sйquence 5889-5937 et
correspondant а la sйquence peptidique YYFDDKGNGEYCFTNT, ont йtй synthйtisйs, afin de fusionner l'extrйmitй C-terminale de la protйine dйlйtйe avec un tag His prйsent sur le vecteur de clonage. La rйaction PCR a йtй rйalisйe grвce а un DNA thermal cycler model 2400 (Perkin-Elmer), avec le systиme Expand Long Templat System (Boehringer Mannheim), suivant le cycle de tempйrature : 94 C pendant 3 min, puis 25 cycles avec : 30 s а 94 C, 30s а 55 C et 7 min а 68 C. Le produit PCR a ensuite йtй clonй dans le vecteur donneur pUNI, et le plasmide rйsultant, utilisй dans une rйaction de recombinaison avec le vecteur d'expression pCR-T7-AdsrE.
La prйparation des extraits cellulaires, les rйactions enzymatiques, l'analyse des produits de la rйaction sont les mкmes que dans l'exemple 3 ci-dessus.
Le profil HPLC des GOS obtenus avec l'enzyme DSR-E dйlйtйe du domaine CD2 apparaоt dans la figure 6 c).

Les GOS de type R, reprйsentйs par les pics 5 et 7 visibles dans la figure 6 a) et 6 b) sont totalement absents des produits obtenus avec l'enzyme recombinante dйlйtйe de CD2. Les seuls produits analysables sont ceux correspondant а des oligosides linйaires rйsultant de liens a (1- 6) avec un rйsidu maltose dans la partie rйductrice. Ce rйsultat indique clairement le rфle essentiel du domaine catalytique situй dans la partie carboxy-terminale de l'enzyme dans sa capacitй а former des liaisons osidiques a (1- > 2).


Exemple 5 : йtude des relations structure-fonction de la protйine DSR-E

Le gиne dsrE, en ce qu'il est le premier gиne codant une dextrane-saccharase catalysant la synthиse de liaisons a (1-2) а avoir йtй clonй, revкt un intйrкt particulier. Il est donc important de caractйriser ce gиne ainsi que son produit d'expression, en l'occurrence en dйterminant quelle est l'implication des diffйrents domaines composant la protйine DSRE dans la fonction qui lui a йtй assignйe, а savoir de correspondre а une dextrane-saccharase spйcifique de la synthиse de liaisons a (1#2).


5.1 Formes dйlйtйes de la protйine DSR-E :

L'йtude de six formes diffйrentes obtenues par dйlйtion d'un ou de plusieurs domaines de la protйine DSR-E a йtй envisagйe afin de dйterminer, en rйfйrence а la Figure 1 ci-dessous : (i) uence de la prйsence du domaine CD2 en йtudiant les constructions GBD-CD2 et A (CD2) ; (ii) t'influence de la prйsence de la zone variable en analysant les formes A (ZV) et CD1-GBD ; et (iii) le potentiel catalytique intrinsиque des domaines CD1 et CD2 exprimйs de faзon isolйe (constructions CD1 et CD2).


L'activitй catalytique de chacune des diffйrentes formes a йtй comparйe а celle observйe avec le contrфle correspondant а la forme entiиre dйlйtйe du seul peptide signal A (PS) [Figure 1c)].

5. 2 Analyse des constructions : A l'issue de la procйdure expйrimentale d'amplification par PCR et de clonage dйtaillйe supra, plusieurs clones prйsentant une insertion selon l'orientation escomptйe ont йtй obtenus pour chacune des constructions envisagйes, а l'exception de la forme tronquйe GBD-CD2 pour laquelle le produit d'amplification souhaitй n'a pu кtre clonй.


Les sйquences des insertions ont йtй dйterminйes afin de s'assurer de l'absence de mutations susceptibles de modifier, aprиs traduction, des acides aminйs situйs au niveau de positions prйsumйes essentielles pour l'activitй enzymatique de la protйine ainsi codйe.
Une mutation a йtй identifiйe au niveau de la 31иme base de l'insertion relative au contrфle A (PS), induisant la substitution d'un acide aspartique par une asparagine en position 10 de la zone variable. N'йtant pas situйe au niveau des motifs rйpйtйs S de la zone variable (Figure 4), il semblerait que l'incidence de cette mutation sur la fonction finalement observйe soit nйgligeable.
Une mutation a йtй introduite dans le produit d'amplification
correspondant а la construction A (CD2), modifiant le rйsidu aromatique F1411 en leucin. Cette mutation est situйe dans le premier tiers du domaine de liaison au glucane GBD, au niveau d'une jonction entre deux motifs rйpйtйs.
La construction A (ZV), eu йgard aux erreurs effectuйes par la
polymйrase lors de la rйaction d'amplification par PCR, ne prйsentait pas la sйquence attendue. En effet, l'insertion contenait un cadre ouvert de lecture, ledit cadre correspondant pour l'essentiel а la forme GBD-CD2 qui n'avait pu кtre clonйe. Cependant, dans la forme GBD-CD2 obtenue en dйfinitive а la place de A (ZV), les 46 rйsidus N-terminaux йtaient absents.
Or, le domaine GBD compte plus de 800 acides aminйs formant un enchaоnement de 24 unitйs rйpйtйes. Cet enchaоnement est tel que, sur les 46 rйsidus tronquйs, seuls les 9 derniers йtaient situйs au niveau de l'une desdites unitйs, et en particulier au niveau de la premiиre d'entre elles. Il

paraissait en consйquence plausible de considйrer que la dйlйtion de ces acides aminйs йtait sans influence sur la rйaction enzymatique catalysйe par la forme protйique correspondante. Cette hypothиse йtait d'autant plus vraisemblable qu'il a йtй montrй sur d'autres dextrane-saccharases, que la perte d'un certain nombre d'unitйs rйpйtйes du domaine GBD ne rйduisait pas l'activitй de la protйine rйsultante de maniиre significative (8).

L'insertion codant la forme CD1-GBD contenait une mutation affectant le rйsidu F633, situй dans le domaine CD1, et plus prйcisйment, au niveau d'une rйgion fortement conservйe parmi les dextranesaccharases, elle-mкme localisйe juste avant le deuxiиme acide aspartique de la triade catalytique (Figure 5). La phйnylalanine attendue йtait substituйe par une leucin. Il est difficile, а ce stade, d'estimer l'impact d'une telle mutation sur l'activitй catalytique observйe.
De la mкme maniиre que pour les autres constructions, la sйquence des insertions codant les domaines catalytiques CD1 et CD2 isolйs est dйterminйe.
5.3 Produits d'expression et activitйs enzvmatiques :

Les protйines correspondant aux diverses formes dйlйtйes de DSR-E ont йtй exprimйes en soumettant les cellules recombinantes de E. coli а une induction par le L-arabinose selon une concentration de 0,002 %.


L'activitй enzymatique a йtй observйe pendant les quatre premiиres heures qui suivaient l'induction.
Les extraits protйiques obtenus par sonication des culots cellulaires ont йtй analysйs en йlectrophorиse SDS-PAGE (Sambrook et Russel, 2001, supra). Les masses molйculaires des protйines recombinantes ont йtй estimйes а partir des profils йlectrophorйtiques obtenus, lesdites masses correspondant pour l'essentiel aux masses attendues, en tenant compte de l'incrйmentation de 12 kDa liйe а l'йtiquette thioredoxine. Le Tableau IV ci-aprиs rйsume les valeurs estimйes des masses molйculaires des diffйrentes formes tronquйes et fournit, а titre de comparaison, les masses attendues.

TABLEAU IV :


Forme protйique Masse attendue Masse attendue + Masse estimйe (kDa) thioredoxine (kDa) (kDa) A (PS) 309 321 324 A (CD2) 218 230 ND GBD-CD2 224 1 233 CD1-GBD 193 205 199 CD1 99 111 111 CD2 95 107 ND
ND : non dйterminй.

Dans le Tableau V suivant, sont indiquйes la nature et la position des acides aminйs marquant le dйbut et la fin des formes protйiques construites dans le cadre de cette йtude. Les diffйrentes positions font rйfйrence а la sйquence ID no. 2 correspondant а la protйine DSR-E.

TABLEAU V :
Forme protйique Acide aminй de Acide aminй de fin Longueur totale dйbut а (PS) N41 12835 2795 A (CD2) M1 L1980 1980 GBD-CD2 M1188 12835 1648 CD1-GBD 1248 L1980 1733 CD1 1248 01141 894 CD2 D1981 12835 855
La forme GBD-CD2 ne possйdait pas l'йtiquette thioredoxine.
En effet, cette forme йtait issue des alйas expйrimentaux occasionnйs par la procйdure d'amplification par PCR de la sйquence censйe coder la forme A (ZV). Eu йgard aux dйlйtions de sйquences alors gйnйrйes, t'йtiquette

thioredoxine, en principe situйe en 5'de la protйine d'intйrкt, n'avait pu кtre fusionnйe avec la rйgion GBD-CD2.


La qualitй des gels d'йlectrophorиse n'a pas permis de dйterminer si le niveau d'expression des diffйrentes formes йtait quantitativement identique et, en consйquence, si lesdites formes йtaient prйsentes dans les mкmes proportions dans les extraits cellulaires.
Aussi les mesures d'activitй fournies ont йtй йtablies sur la base d'un volume donnй d'extraits cellulaires, mais n'ont pu кtre ramenйes а la quantitй de chaque protйine rйellement contenue dans ledit volume d'extraits.
La synthиse de polymиres de dextrane in situ par incubation des gels d'йlectrophorиse dans une solution de saccharose, et la coloration au rйactif de Schiff subsйquente ont confirmй la prйsence de protйines possйdant une activitй glucane-saccharase dans les extraits cellulaires correspondant а A (PS), A (CD2), GBD-CD2 et CD1-GBD.
Dans le Tableau VI ci-dessous, sont prйsentйes les activitйs enzymatiques maximales observйes pour chaque construction. Les rйsultats ont confirmй les donnйes tirйes des expйriences de coloration des gels au rйactif de Schiff, а savoir le fait que les extraits cellulaires relatifs aux formes A (PS), A (CD2), GBD-CD2 et CD1-GBD prйsentaient une activitй saccharase, а l'inverse des deux domaines catalytiques pris isolйment. Ce rйsultat йtait conforme а la littйrature, йtant donnй qu'il avait йtй montrй pour d'autres dextrane-saccharases, que l'absence du domaine GBD induisait une perte d'activitй enzymatique drastique (8,9, 10). TABLEAU VI :
Forme A (PS) A (CD2) GBD-CD2 CD1-GBD CD1 CD2 protйique Activitй 1063 181 86 235 5, 3 0 maximale (U/I)

La forme CD1 possйdait une activitй intrinsиque de niveau suffisant pour кtre dйtectйe. Quant а la forme GBD-CD2, elle prйsentait un niveau d'activitй non nйgligeable, dont on pouvait conclure que l'organisation structurale correspondante, а savoir un domaine catalytique en aval du domaine de liaison au glucane, demeurait enzymatiquement active.


5. 4 Effets des dйlйtions sur la synthиse d'oliqosides : Dans la mesure oщ la spйcificitй de synthиse des liaisons a (1-72) est conservйe lors de la rйaction en prйsence d'un accepteur, des expйriences de synthиse d'oligosides а partir de maltose ont d'abord йtй effectuйes (Figure 7).
Lorsque les rйactions ont йtй menйes а leur terme, c'est-аdire lorsque tout le saccharose a йtй consommй, les rendements de synthиse en oligosides ont йtй calculйs. Les rйsultats apparaissent dans le Tableau VII suivant. Seule la rйaction impliquant l'extrait cellulaire contenant la forme protйique CD1 n'a pu permettre un tel calcul. L'effet de la tempйrature a probablement conduit а l'inactivation de la trиs faible activitй prйsente dans l'extrait protйique.
TABLEAU Vt) :
Forme protйique Rendement en Rendement en Rendement en oligosides de la sйrie oligosides de la sйrie oligosides totaux OD (%) R (%) Enzyme native 36 28 64 A (PS) 41 14 55 ACD2) 67 1 68 GBD-CD2 45 47 92 CD1-GBD 100 0 100
Comme indiquй sur la Figure 7 ci-dessous, la prйsence d'oligosides de la sйrie R n'йtait dйcelйe qu'avec les formes enzymatiques possйdant le domaine catalytique CD2, а l'exception du cas oщ ledit domaine йtait isolй et alors rendu complиtement inactif. En effet, les temps de rйtention des oligosides synthйtisйs par la forme dйlйtйe du deuxiиme domaine catalytique, ainsi que par la forme CD1-GBD, correspondaient uniquement а ceux de la sйrie OD, c'est а dire aux GOS dйpourvus de liaisons a (1-72). Ces rйsultats indiquaient donc que le domaine CD2 йtait requis pour la formation des liaisons a (1-2).
Les produits obtenus avec la forme GBD-CD2 ont permis d'йtayer ces observations. Cette construction, qui possйdait CD2 comme seul domaine catalytique, йtait capable de catalyser de maniиre prйpondйrante la synthиse d'oligosides de la sйrie R, possйdant des liaisons a (1-2) Ce rйsultat dйmontrait donc que la spйcificitй en terme de fonction de l'enzyme DSR-E rйside dans la sйquence trиs originale de ce domaine, et non pas dans l'association de deux domaines catalytiques. En outre, la forme protйique GBD-CD2 permettait йgalement la synthиse de liaisons a (1-6). Toutefois, les faibles rendements obtenus pour ces oligosides indiquaient qu'ils йtaient prйfйrentiellement convertis en oligosides de degrй de polymйrisation supйrieur appartenant а la sйrie R, ce qui empкchait leur accumulation dans le milieu rйactionnel, а la diffйrence des molйcules de la sйrie R qui, elles, n'йtaient pas converties (2).
En comparant les profils des produits obtenus, tels que montrйs а la Figure 7, il est apparu que la forme entiиre A (PS) synthйtisait majoritairement des oligosides linйaires. En effet, la molйcule R4 йtait absente et l'oligoside R5 faiblement prйsent. Le domaine catalytique CD1 permettait, quant а lui, de catalyser la synthиse exclusive de liaisons a (1-76) et son activitй semblait prйpondйrante par rapport а celle du domaine CD2. Aussi, dans la forme entiиre de l'enzyme, l'implication du domaine CD2 serait donc moins importante du fait de : (i) paramиtres

catalytiques intrinsиques plus faibles ; et/ou (ii) d'une configuration globale de l'enzyme dйfavorable а son activitй.


En outre, l'enzyme entiиre а (PS) catalysait la synthиse d'oligosides de la sйrie R avec un rendement infйrieur а celui observй avec le mйlange de dextrane-saccharases produit par L. mesenteroides NRRL B-1299 (Figure 7). Le rendement obtenu, de 28 %, йtait situй entre ceux observйs avec la forme entiиre A (PS) d'une part, et la forme GBD-CD2 d'autre part. Or, t'on sait que la souche sauvage produit plusieurs formes de dextrane-saccharases susceptibles de synthйtiser des liaisons osidiques, et notamment des liaisons a (172). Une hypothиse avait йtй йmise, selon laquelle lesdites formes йtaient des produits de dйgradation de DSR-E. Ainsi, dans la mesure oщ des formes tronquйes de DSR-E, telles GBD-CD2, pouvaient catalyser la synthиse d'oligosides de la sйrie R plus efficacement, il semblerait que les rendements obtenus avec le mйlange hйtйrogиne produit par L. mesenteroides NRRL B-1299 soient imputables а la contribution des activitйs catalytiques de l'ensemble de ces diffйrentes formes enzymatiques.
En conclusion, les inventeurs ont rйussi, en isolant une dextrane saccharase particuliиre produite par L. mesenteroides, а caractйriser une structure particuliиre et inattendue de cette enzyme apte а produire des oligosides d'intйrкt et prйsentant des ramifications de type a (1-2). L'identification et la caractйrisation de cette sйquence permettent d'une part de construire des cellules ou organismes recombinants exprimant de faзon spйcifique cette enzyme et, d'autre part, d'en envisager sa modification par mutagenиse dirigйe ou alйatoire ou par йvolution molйculaire (DNA Shuffling) afin d'en amйliorer encore ses caractйristiques.
Cette invention permet en outre d'amйliorer le rendement et la reproductibilitй de la production des GOS d'intйrкt pour les diffйrentes applications citйes ci-avant.

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Biotechnol. 48,465-472Claims:
REVENDICATIONS
1. Polypeptide isolй ayant une activitй enzymatique de glycosyltransfйrase apte а former des dextranes prйsentant des ramifications a (1 -* 2) а partir de saccharose, d'a-D-fluoro-glucose, de para-nitrophйnyl-a-D-g 1 ucopyranoside, d'a-D-glucopyranoside-aD- sorbofurano-side ou de 4-0-aD-galactopyranosylsucrose, caractйrisй en ce qu'il comprend au moins un domaine de liaison au glucane et un domaine а activitй catalytique situй en aval du domaine de liaison au glucane.
2. Polypeptide selon la revendication 1 comprenant au moins deux domaines catalytiques situйs de part et d'autre du domaine de liaison au glucane.
3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 comprenant un peptide signal, une rйgion variable, deux domaines catalytiques et un domaine de liaison au glucane situй entre les deux domaines catalytiques.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 а 3 dans lequel le ou les domaine (s) а activitй catalytique a (ont) un pourcentage de similaritй compris entre 65 % et 100 % avec la SEQ. ID n'l.
5. Polypeptide selon l'une des revendications prйcйdentes dans lequel la taille du domaine de liaison au glucane est supйrieure а 500 aminoacides.
6. Polypeptide selon la revendication 5 ayant la SEQ. ID no2.
7. Polypeptide selon la revendication 6 modifiй par substitution, insertion, dйlйtion de sйquences d'acides aminйs et

comportant des sйquences prйsentant au moins 80 % et de prйfйrence au moins 90 % de similaritй avec les sйquences suivantes de la sйquence ID n 2 : 423-439 (SEQ. ID n 6) 2120-2138 (SEQ. IDn 12) 478-501 (SEQ. ID n 7) 2161-2184 (SEQ. IDDn 13) 519-539 (SEQ. ID n 8) 2202-2214 (SEQ. IDn 14) 560-571 (SEQ. ! D n 9) 2243-2250 (SEQ. ! D n 15) 631-645 (SEQ. IDDn 10) 2315-2322 (SEQ. IDn 16) 1014-1021 (SEQ IDn 11) 2689-2696 (SEQ. ID n 17)

8. Polypeptide selon la revendication 7 dans lequel les acides aminйs suivants sont inchangйs :

W en positions 425 et 2122,

E en positions 430,565 et 2127,2248,

D en positions 487,489, 527,638, 2170,2172, 2210 et

2322,

H en position 637 et 2321,



Q en position 1019 et 2694.
9. Acide nuclйique isolй codant une enzyme а activitй glycosyltransfйrase apte а former des dextranes prйsentant des ramifications a (1- 2) а partir de saccharose, d';-D-fluoro-glucose, de
para-nitrophйnyt-a-D-gtucopyranoside, d'a-D-gtucopyranoside-oDsorbofurano-side ou de 4-0-a-D-galactopyranosylsucrose, et comprenant au moins une sйquence nuclйotidique codant un domaine catalytique ayant au moins 50 %, et de prйfйrence au moins 80 % d'identitй avec la s#quence ID n 3, et situй en 3'd'une sйquence codant un domaine de liaison au glucane.

10. Acide nuclйique selon la revendication 9 comprenant : a) deux sйquences codant des domaines catalytiques ayant au moins 50 %, et de prйfйrence au moins 80 % d'identitй avec la sйquence ID no 3 ; b) une sйquence codant le domaine de liaison au glucane, ce dernier йtant situй de prйfйrence entre les deux sйquences en a).


11. Acide nuclйique isolй selon la revendication 10 prйsentant au moins 80 % d'identitй avec a) la sйquence ID n'4 ou b) le brin complйmentaire de la sйquence en a), ou c) une sйquence hybridant a) ou b) en conditions stringentes.

12. Acide nuclйique isolй selon la revendication 11 constituй de la sйquence ID n 4 ou son brin complйmentaire ou de la sйquence dйduite de la dйgйnйrescence du code gйnйtique.


13. Acide nuclйique isolй selon la revendication 11 comprenant : a) une sйquence ayant au moins 80 % d'identitй avec la sйquence codant une dextrane saccharase exprimйe par le plasmide pCR- T7 -dsrD dйposй а la CNCM le 15 mars 2001 sous le numйro 1-2649, ou b) une sйquence complйmentaire de la sйquence en a)

14. Vecteur d'expression comprenant un acide nuclйique selon l'une quelconque des revendications 9 а 13.


15. Vecteur selon la revendication 14 dans lequel l'acide nuclйique est sous le contrфle de sйquence permettant son expression dans des cellules procaryotes ou eucaryotes.

16. Cellule hфte transformйe par un acide nuclйique selon l'une des revendications 9 а 13 ou un vecteur selon l'une des revendications 14 а 15.


17. Cellule transformйe selon la revendication 16 choisie dans
un groupe comprenant E. coli, les Leuconostoc, les vйgйtaux, les Lactococcus et les Bacillus ou les levures.
18 cellule transformйe selon la revendication 17 caractйrisйe en ce qu'il s'agit d'une souche de E. coli dйposйe а la CNCM le 15 mars 2001 sous le n'1-2649.
19. Procйdй de production d'une dextrane saccharase apte а former des liaisons a1- 2 comprenant : a) l'insertion d'un acide nuclйique selon l'une des revendications 9 а 13 ou un vecteur selon l'une des revendications 14 а 15 dans une cellule hфte selon la revendication 16 ; b) la purification de l'enzyme а partir d'un extrait cellulaire.
20. Procйdй selon la revendication 19 dans lequel la cellule hфte est un procaryote choisi dans un groupe comprenant E. coli, les Lactococci, les Bacillus, les Leuconostoc.
21. Procйdй selon la revendication 19 dans lequel la cellule hфte est un eucaryote choisi dans un groupe comprenant les levures, les champignons, les vйgйtaux.
22. Procйdй d'obtention d'une dextrane saccharase apte а former des oligosides ou des dextranes prйsentant un taux de liaison cx (1- 2) supйrieur а 30 % des liaisons totales comprenant une йtape de

modification de la sйquence ID no 4 par addition, dйlйtion, mutation а partir du moment ou : - le cadre de lecture n'est pas modifiй, et - les acides aminйs suivants sont conservйs aprиs traduction :

W en positions 425 ou 2122, codй par le triplet TGG en positions 1273 et 6364,

E en positions 430,565, 2127 et 2248 codйs par les triplets GM en positions 1288,1693, 6379 et 6742 respectivement,

D en positions 487,489, 527,638, 2170 et 2210 codйs par les triplets GAT en positions 1459,1465, 1579,1912,

6508 et 6628 respectivement,

D en positions 2172 et 2322 codйs par les triplets GAT en positions 6514 et 6964,

H en position 637 et 2321, codйs respectivement par les triplets CAT en position 1909 et CAC en position 6961,

Q en positions 1019 et 2694 codйs respectivement par les triplets CM (3055) et CAG (8080).
23. Procйdй d'obtention d'une glycosyltransfйrase isolйe apte а former des oligosides ou des dextranes prйsentant un taux de liaison a (1-2) supйrieur а 30 % comprenant : - une йtape de modification alйatoire de la sйquence ! D n 4 et d'йtablissement d'une banque de variants, - une йtape d'expression de ces sйquences modifiйes dans une cellule hфte appropriйe, un hфte abritant un variant, - une йtape de criblage des hфtes exprimant une enzyme apte а former plus de 30 % de liaison a (1 -+ 2) sur un substrat appropriй, - une йtape d'isolement du ou des gиnes amйliorйs.
24 Glycosyltransfйrase apte а former au moins 30 % de liaison a (1-) 2) susceptible d'кtre obtenue par un procйdй selon l'une des revendications 19 а 22.
25. Utilisation d'une glycosyltransfйrase obtenue par un procйdй selon l'une des revendications 19 а 22 dans la fabrication d'une composition а effet prйbiotique.
26. Utilisation d'une glycosyltransfйrase obtenue par un procйdй selon l'une des revendications 19 а 23 dans la fabrication d'une composition pharmaceutique ou cosmйtique.

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