Probiotic composition based on the enterococcus strain and used as a treatment means and method for the production thereof



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39. ES2216704 - 16.10.2004
PROCEDURE IS FOR PREPARATION OF MARINE PROBIOTIC BACTERIA ROSEOBACTER SP. PP-154 FOR CONTROL OF MORTALITY IN MOLLUSC, CRUSTACEAN AND FISH FARMS

URL EPO = http://v3.espacenet.com/textdoc?F=3&CY=ep&LG=en&IDX=ES2216704


Inventor(s): BARJA PEREZ JUAN LUIS (ES); PRADO PLANA SUSANA (ES); ESTEVEZ TORANZO ALICIA (ES); MONTES PEREZ JAIME (ES)
Applicant(s): UNIV SANTIAGO COMPOSTELA (ES)
IP Class 4 Digits: A23K; C12N; A01K
IP Class: A23K1/00; C12N1/20; A23K1/10; A01K61/00
Application Number: ES20030000793 (20030403)
Priority Number: ES20030000793 (20030403)
Family: ES2216704
Abstract:

THE PROCEDURE IS FOR THE PREPARATION OF MARINE PROBIOTIC BACTERIA ROSEOBACTER SP. PP-154 FOR THE CONTROL OF MORTALITY IN MOLLUSC, CRUSTACEAN AND FISH FARMS. THE BACTERIA ARE CULTIVATED IN MARINE BROTH AT 25 DEGREES CELSIUS, WITH STIRRING. THE CELLS ARE RECOVERED BY CENTRIFUGATION. THE PRECIPITATE IS RESUSPENDED IN A SOLUTION OF SKIMMED MILK AT 20 PER CENT. IT IS THEN PLACED INTO AMPULES, DEEP-FROZEN AND LYOPHILIZED. THE PRODUCT IS STORED AT AMBIENT TEMPERATURE. THE LYOPHIL IS REHYDRATED WITH STERILE SEA WATER. DIRECTLY ADDED TO THE CULTURE WATER ARE PHYTOPLANKTON, ARTEMIA AND ROTIFER, CONTROLLING THE BACTERIAL POPULATIONS IN THEM. IN THE CASE OF ARTEMIA AND ROTIFER, BIO-ENCAPSULATION CAN BE OBTAINED. THAT IS TO SAY, THE SUPPLY OF THE PROBIOTIC TO LARVAL CULTURES AND THOSE POST-LARVAL VIA THE FOOD. THE STRAINS ARE DEPOSITED IN THE SPANISH COLLECTION OF TYPE CULTURES CECT 5891.



40. FR2822163 - 20.09.2002
NEW GLYCOSYL TRANSFERASE ENZYMES, CONTAINING GLUCAN BONDING AND CATALYTIC DOMAINS AND PRODUCING ALPHA-(1-2) BRANCHED DEXTRANS, USEFUL IN PROBIOTIC, PHARMACEUTICAL OR COSMETIC COMPOSITIONS

URL EPO = http://v3.espacenet.com/textdoc?F=3&CY=ep&LG=en&IDX=FR2822163


Inventor(s): BOZONNET SOPHIE ANNE MICHELE (--); REMAUD SIMEON MAGALI MARTINE C (--); WILLEMOT RENE MARC LUCIEN (--); MONSAN PIERRE EMMANUEL FREDERI (--)
Applicant(s): CENTRE NAT RECH SCIENT (FR)
IP Class 4 Digits: A61K; C12N; C12P
IP Class: C12N1/21; C12N9/10; C12N15/54; C12N15/63; C12P21/02; A61K38/45; A61K7/00
E Class: C12N9/10D1A
Application Number: FR20010016495 (20011219)
Priority Number: FR20010016495 (20011219); FR20010003631 (20010316)
Family: FR2822163
Equivalent: EP1427818WO02074943; WO02074943
Abstract:

NEW ISOLATED POLYPEPTIDES (I), WITH GLYCOSYL TRANSFERASE ACTIVITY SUITABLE FOR PRODUCING DEXTRANS HAVING ALPHA (1-2) BRANCHES FROM SUCROSE, ALPHA -FLUOROGLUCOSE, P-NITROPHENYL- ALPHA -D-GLUCOPYRANOSIDE, ALPHA -D-GLUCOPYRANOSIDE- ALPHA -D-SORBOPYRANOSIDE OR ALPHA -D-GALACTOPYRANOSYL-SUCROSE, AND AT LEAST ONE GLUCAN BONDING DOMAIN (GBD) AND A CATALYTIC DOMAIN (CD) DOWNSTREAM OF THE GBD, ARE NEW. INDEPENDENT CLAIMS ARE ALSO INCLUDED FOR: (1) AN ISOLATED NUCLEIC ACID ENCODING (I), HAVING AT LEAST ONE NUCLEOTIDE SEQUENCE ENCODING A CD AND WITH AT LEAST 50% (PREFERABLY AT LEAST 80%) HOMOLOGY WITH A SEQUENCE OF 2568 BASES GIVEN IN THE SPECIFICATION (S3), LOCATED AT 3' RELATIVE TO A SEQUENCE ENCODING A GBD; (2) AN EXPRESSION VECTOR CONTAINING A NUCLEIC ACID AS IN (1) (PREFERABLY UNDER THE CONTROL OF SEQUENCES ALLOWING EXPRESSION IN PROKARYOTIC OR EUKARYOTIC CELLS); (3) HOST CELLS TRANSFORMED BY A NUCLEIC ACID AS IN (1) OR A VECTOR AS IN (2); (4) METHODS FOR THE PRODUCTION OF (I) (SPECIFICALLY DEXTRAN SACCHARASES); (5) GLYCOSYL TRANSFERASES FORMING AT LEAST 30% ALPHA (1-2) BONDS OBTAINED AS IN (4); (6) THE PRODUCTION OF A DEXTRAN SACCHARASE (I'), SUITABLE FOR FORMING OLIGOSIDES OR DEXTRANS HAVING MORE THAN 30% ALPHA (1-2) BONDS, INVOLVING MODIFICATION OF A FULLY DEFINED SEQUENCE OF 8506 BASES GIVEN IN THE SPECIFICATION (S4) BY ADDITION, DELETION AND MUTATION, SUCH THAT WHEN THE READING FRAME IS NOT MODIFIED, THE FOLLOWING AMINOACIDS ARE RETAINED: W IN POSITIONS 425 AND 2122 (ENCODED BY TGG IN POSITIONS 1273 AND 6364), E IN POSITIONS 430, 565, 2127 AND 2248 (ENCODED BY GAA IN POSITIONS 1288, 1693, 6379 AND 6742), D IN POSITIONS 487, 489, 527, 638, 2170, 2172, 2210 AND 2322 (ENCODED BY GAT IN POSITIONS 1459, 1465, 1579, 1912, 6508 AND 6628), H IN POSITIONS 637 AND 2321 (ENCODED BY CAT IN POSITION 1909 AND CAC IN POSITION 6961) AND Q IN POSITIONS 1019 AND 2694 (ENCODED BY CAA IN POSITION 3055 AND CAG IN POSITION 8080); AND (7) THE PRODUCTION OF A GLYCOSYL TRANSFERASE (I''), SUITABLE FOR FORMING OLIGOSIDES OR DEXTRANS HAVING MORE THAN 30% ALPHA (1-2) BONDS, BY RANDOM MUTATION OF (S4), FORMING A LIBRARY OF VARIANTS, EXPRESSING THESE MODIFIED SEQUENCES IN A SUITABLE HOST CELL, SCREENING THE HOSTS FOR EXPRESSION OF (I'') AND ISOLATING THE IMPROVED GENES.Description:

MOLECULES D'ACIDES NUCLEIQUES CODANT UNE DEXTRANE-

SACCHARASE CATALYSANT LA SYNTHESE DE DEXTRANE PORTANT DES RAMIFICATIONS DE TYPE ALPHA-1,2 OSIDIQUES

La prйsente invention relиve du domaine de la glycotechnologie et plus particuliиrement de la synthиse d'oligosaccharides ou oligosides а effet prйbiotique, thйrapeutique ou diagnostique.
La prйsente invention porte sur des molйcules d'acides nuclйiques codant une enzyme ayant une activitй de glycosyltransfйrase catalysant la synthиse de dextranes ou d'oligosides portant des
ramifications de type < x (1-) 2) osidiques.
L'invention porte en outre sur les enzymes synthйtisйes par les acides nuclйiques selon l'invention, ainsi que sur leurs systиmes d'expression dans des cellules procaryotes ou eucaryotes. Elles portent enfin sur l'utilisation desdites enzymes dans la production d'oligosaccharides dans l'alimentation, ou en tant que principe actif de produits thйrapeutiques et/ou cosmйtiques.
Les oligosides et hйtйrooligosides jouent le rфle de signaux de reconnaissance et d'effecteur chez l'animal comme dans les plantes (on parle alors d'oligosaccharines), en se liant spйcifiquement а des lectines, des glycosyltransfйrases, des glycosidases, des molйcules d'adhйsion, etc... Ainsi, les dйterminants antigйniques des groupes sanguins sont des osides, et notre dйfense contre nombre de bactйries pathogиnes est dirigйe contre les structures osidiques de l'enveloppe bactйrienne. Par ailleurs, l'une des raisons majeures du rejet des xйnogreffes est l'existence de structures osidiques propres а chaque espиce. Ces propriйtйs, ainsi que les connaissances acquises ces derniиres annйes sur les glycosyltransfйrases et les lectines, contribuent а faire de certains oligosides des candidats de choix pour la thйrapeutique ou la prophylaxie des dйsordres liйs а l'йquilibre microbiologique de diffйrents organes tels

l'intestin, ou la peau. Par exemple, les oligosides constituent une alternative intйressante а l'utilisation de microorganismes et d'antibiotiques pour rйguler la composition de la flore intestinale (effet prйbiotique). Certains oligosides peuvent кtre considйrйs comme des"fibres solubles"lorsqu'ils ne sont pas mйtabolisйs par les enzymes digestives humaines et animales ; en gagnant le cфlon, ils interagissent avec la flore microbienne et affectent spйcifiquement la croissance et l'adhйsion de certaines espиces.


Incorporйes а faible dose (moins de 1 %) dans l'alimentation, certaines de ces molйcules osidiques amйliorent l'йtat de santй et stimulent la prise de poids des animaux.
Une revue des diffйrentes glycosyltransfйrases, leur structure et leur activitй, est dйcrite dans Vincent Monchois et al. (1). Briиvement : a) Il apparaоt que la structure des glycosyltransfйrases et/ou dextrane-saccharases йtudiйes est trиs conservйe et est constituйe, partant de la partie aminйe de la protйine, d'une sйquence signal, d'un domaine variable, d'un domaine catalytique et d'un domaine de liaison au glucane. b) Les glucooligosides (GOS) sont synthйtisables par des glycosyltransfйrases telles les dextrane-saccharases, а partir de substrats peu coыteux tel le saccharose et en prйsence d'un sucre accepteur de glucose. D'autres substrats, tels l'a-D-fluoro-glucose, le paranitrophйnyl-a- D-glucopyranoside, l'a-D-glucopyranoside-a-D-sorbofuranoside ou le 4-0- a-D-galactopyranosylsucrose peuvent йgalement кtre utilisйs.
Ces enzymes catalysent а partir du substrat le transfert d'unitйs glucose sur des molйcules acceptrices. En prйsence d'un accepteur de glucose tel le maltose, ou l'isomaltose, les glycosyltransfйrases catalysent la synthиse d'oligosaccharides de bas poids molйculaire comprenant majoritairement des chaоnes de 3 а 7
glucoses, selon la rйaction :
saccharose + accepteur--- accepteur glucosylй + fructose
En pareil cas, les enzymes prйsentent gйnйralement une spйcificitй de synthиse de liaisons osidiques conformes а celle formant le polymиre donneur.
En revanche, en absence d'accepteur, l'enzyme synthйtise des glucanes de haut poids molйculaire de type dextrane par transferts successifs d'unitйs ;-D-glucopyranosyles а partir de saccharose, conformйment а la rйaction :
n saccharose (glucose) n + n fructose c) Les structures et la fonction des glucanes ou des oligosides synthйtisйs par les glycosyltransfйrases dйpendent de la souche bactйrienne productrice.
Dans l'ensemble de ce texte, on appellera de faзon gйnйrique des glycosyltransfйrases les diffйrentes enzymes capables de catalyser la synthиse de polymиres de glucose а partir de saccharose. Elles sont gйnйralement produites par des souches bactйriennes de type Leuconostoc, Lactococcus, Streptococcus ou Neisseria. La taille et la structure des glucanes produits dйpendent de la souche productrice.
Les unitйs de glucose sont couplйes par des liaisons osidiques a (1#6) comme dans le dextrane, par des liaisons a (1#3), comme dans le cas du mutane, ou par une alternance des deux types (alternane).
De la mкme faзon, l'existence et la nature des ramifications, leur longueur et leur position varient selon l'origine de la souche productrice.
Les glycosyltransfйrases produisant des glucanes ou des GOS contenant au moins 50 % de liaison a (1-+6) sont appelйes dextrane-
saccharases. Les GOS synthйtisйs par ces enzymes portent, le cas йchйant, des ramifications a (1--2), a (1-3) et/ou a (1- > 4). Lesdites dextrane-saccharases sont produites notamment par des bactйries de type Leuconostoc mesenteroides.

d) La dextrane-saccharase de L. mesenteroides NRRL B- 1299 a la particularitй de produire, quant а elle, un dextrane hautement ramifiй dont la majoritй des ramifications sont de type a (1-2). Utilisйe en prйsence de saccharose et de maltose, molйcule acceptrice de glucose, elle conduit а la formation de GOS prйsentant pour certains une liaison a (1-2) а leur extrйmitй non rйductrice et pour d'autres des ramifications a (1-+2) sur les rйsidus intermйdiaires entre les extrйmitйs. A ce titre, ils rйsistent а la dйgradation par les enzymes (hydrolases) du tractus digestif supйrieur, chez l'homme et l'animal, et ne sont dйgradйs que par des genres bactйriens capables de fermenter tels Bacteroides et Bifidobacterium, considйrйs comme bйnйfiques pour l'organisme de l'hфte.


Un phйnomиne identique se produit au niveau de la peau, permettant d'envisager des applications en cosmйtologie, car c'est le dйsйquilibre de la flore microbienne cutanйe qui est а l'origine de nombreux problиmes cosmйtiques et dermatologiques. C'est en raison de ces caractйristiques qu'ils sont dйsignйs ici par le terme GOS d'intйrкt.
Dans l'ensemble du texte, les polysaccharides synthйtisйs par les glycosyltransfйrases selon l'invention sont soit des dextranes de haut poids molйculaire lorsque la rйaction est rйalisйe sans accepteur de glucose, soit des oligosides lorsque la rйaction est rйalisйe en prйsence d'accepteur de glucose tel le maltose ou l'isomaltose sans que cela soit nйcessairement spйcifiй. En effet, la fonctionnalitй de l'enzyme est caractйrisйe par la nature des liaisons glucose-glucose [a (1-6), a (1- > 2)] ou autres et non par le poids molйculaire du polysaccharide synthйtisй.
Les dextrane-saccharases de L. mesenteroides trouvent dйjа de nombreuses applications dans l'industrie, et en particulier celles de la souche NRRL B-1299 pour lesquelles un procйdй de synthиse des GOS prйsentant des ramifications a (1-2) a йtй dйcrit dans le brevet EP 0325 872 B1.
Marguerite Dols et al. (2) ont montrй que les GOS produits par les dextrane-saccharases de cette souche sont en fait un mйlange d'au

moins trois familles de molйcules similaires diffйrant de fait par le nombre et le positionnement des ramifications de type a (1-2), ce qui amиne l'hypothиse de l'existence de diffйrentes activitйs enzymatiques de type glycosyltransfйrase dans cette souche bactйrienne.


Compte tenu de l'intйrкt industriel dans le domaine des aliments prйbiotiques, en cosmйtologie ou en pharmacie des GOS prйsentant des ramifications a (1- > 2) et rappelй ci-dessus, la prйsente invention vise а isoler et caractйriser une enzyme particuliиre parmi celles produites par L. mesenteroides NRRL B-1299 qui serait plus particuliиrement impliquйe dans la synthиse d'oligosides prйsentant les ramification a (1-+2). L'identification et la caractйrisation d'une telle enzyme offrent l'avantage, d'une part, de fournir un procйdй de production uniforme et reproductible des GOS d'intйrкt et, d'autre part, d'identifier les caractйristiques essentielles de l'enzyme productrice de ces GOS d'intйrкt, afin, le cas йchйant, d'amйliorer les performances des produits de la rйaction enzymatique en fonction de l'utilisation envisagйe.
Le problиme technique sous-tendu dans la prйsente invention йtait ainsi de pouvoir disposer d'une enzyme et donc des acides nuclйiques
isolйs codant cette enzyme permettant la production amйliorйe de GOS а ramifications a (1-2).
La prйsente invention apporte une solution technique aux diffйrentes questions йvoquйes ci-avant en fournissant une nouvelle dextrane-saccharase, appelйe DSR-E codйe par un gиne dotй d'une
structure nouvelle et inattendue (dsrE) et capable de catalyser la synthиse des glucanes ou des oligosaccharides contenant des ramifications a (1-"2) Entre la date de dйpфt de la demande de brevet franзais N 0103631, dont la prioritй est revendiquйe et dans laquelle la dextranesaccharase objet de l'invention йtait appelйe DSR-D, et celle de la prйsente demande, une autre dextrane-saccharase, diffйrente de l'enzyme objet de l'invention, a йtй dйcrite et йgalement nommйe DSR-D. C'est pourquoi, dans le cadre de la prйsente demande de brevet, la dextrane-saccharase

dйcrite, revendiquйe et reprйsentйe а la figure 1 b) est dйnommйe non plus DSR-D comme dans le document de prioritй, mais DSR-E. De fait, les dextrane-saccharases DSR-D selon ledit document de prioritй et DSR-E sont en tout point identiques.


Par structure nouvelle et inattendue, on entend le fait que l'organisation de la protйine diffиre de celle de toutes les autres glycosyltransfйrases dйcrites а ce jour (1) et dont le domaine catalytique est situй en amont d'un domaine de liaison au glucane, ce dernier constituant la partie carboxylique de la protйine.
Ainsi, la prйsente invention porte sur un polypeptide isolй ayant une activitй enzymatique de glycosyltransfйrase apte а former des dextranes prйsentant des ramifications a (1-2), caractйrisй en ce qu'il comprend au moins un domaine de liaison au glucane et un domaine а activitй catalytique situй en aval du domaine de liaison au glucane. Par situй en aval, on entend le fait que la partie aminйe de la sйquence а activitй catalytique ou domaine catalytique est proximale de la partie carboxylique du domaine de liaison au glucane. Ces deux domaines peuvent кtre immйdiatement contigus ou au contraire sйparйs par une rйgion variable.
La glycosyltransfйrase selon l'invention comporte de prйfйrence un peptide signal.
Dans un mode de rйalisation de l'invention, la glycosyltransfйrase comprend deux domaines catalytiques situйs de part et d'autre du domaine de liaison au glucane.
La prйsence d'un domaine а activitй catalytique dans la partie carboxylique de l'enzyme est une caractйristique essentielle de cette derniиre dans sa capacitй а former des liaisons a (1-2) osidiques. En effet, comme le montrent les expйriences dйcrites ci-aprиs, la dйlйtion de ce domaine dans une enzyme ayant au moins deux domaines catalytiques conduit а la production de glucanes ou d'oligosides ayant essentiellement

des liaisons osidiques de type a (1-)-6) et dйpourvus de liaisons de type a (1-2).


Plus prйcisйment, le domaine catalytique, dиs lors qu'il est situй en aval d'un domaine de liaison au glucane, permet la synthиse d'oligosides contenant des liaisons a (12).
En outre, les expйriences dйcrites ci-aprиs dйmontrent que la spйcificitй de fonction de la dextrane-saccharase DSR-E, а savoir sa
capacitй а catalyser la formation de liaisons osidiques a (1-2) est imputable, non pas а la prйsence concomitante de deux domaines catalytiques, mais plutфt а l'enchaоnement d'un domaine de liaison au glucane et d'un domaine catalytique, et plus particuliиrement du domaine catalytique CD2.
L'analyse comparative des diffйrentes glycosyltransfйrases incluant les dextrane-saccharases a mis en йvidence un trиs fort degrй de conservation de leur domaine catalytique.
Le domaine catalytique situй dans la partie carboxy-terminale de la glycosyltransfйrase selon l'invention a une sйquence prйsentant au moins 44 % d'identitй et 55 % de similaritй avec les domaines catalytiques
des autres glycosyltransfйrases analysйes. En particulier, le domaine catalytique dans la partie carboxylique de la glycosyltransfйrase selon l'invention a au moins 65 % d'identitй et au moins 80 % de similaritй avec la sйquence ID No. 1, la triade catalytique Asp/Glu/Asp en positions respectives 230/268/342 йtant conservйe.
Dans l'ensemble du texte, on entend par X% de similaritй par rapport а une sйquence de rйfйrence le fait que X % des acides aminйs sont identiques ou modifiйs par substitution conservative telle que dйfinie dans le logiciel d'alignement des sйquences d'acides aminйs ClustalW (http :///bloweb. pasteur fr/docs/doc-qensoft/clustalw//) et que (100-X) % peuvent кtre dйlйtйs, substituйs par d'autres amino-acides, ou encore que (100-X) % peuvent кtre ajoutйs а la sйquence de rйfйrence. Une structure primaire particuliиre de l'enzyme selon l'invention est reprйsentйe dans la

sйquence ID No. 2 qui reprйsente une sйquence de 2835 acides aminйs d'une dextrane-saccharase de L. mesenteroides NRRL B-1299.


Cette dextrane-saccharase, nommйe DSR-E, possиde comme la plupart des glycosyltransfйrases et des dextrane-saccharases une sйquence signal, une rйgion variable faiblement conservйe, un domaine catalytique hautement conservй (CD1), un domaine de liaison au glucane (GBD) et un deuxiиme domaine catalytique (CD2) dans la partie carboxylique de la protйine. DSR-E est la premiиre glycosyltransfйrase analysйe et prйsentant deux domaines catalytiques, dans la configuration prйsentйe dans la figure 1 b). C'est йgalement la premiиre glycosyltransfйrase dont un domaine catalytique est situй dans la partie carboxylique de la protйine.
La figure 1b) fait apparaоtre йgalement que le domaine de liaison au glucane est sensiblement plus long que celui dйcrit prйcйdemment pour les dextranes saccharases connues ; ainsi, une autre caractйristique des enzymes selon l'invention est la taille de ce domaine qui est supйrieur а 500 amino-acides.
La comparaison et l'analyse de la sйquence de DSR-E avec les sйquences des glycosyltransfйrases ou des dextrane-saccharases dйjа dйcrites (1), ainsi que les moyens utilisйs а cette fin sont indiquйs dans l'exemple 2 dйtaillй ci-aprиs. Il y apparaоt clairement que si l'existence de deux domaines catalytiques diffйrencie substantiellement DSR-E des autres enzymes, en revanche les sйquences desdits domaines sont substantiellement conservйes. En particulier, les acides aminйs nйcessaires а l'activitй catalytique sont conservйs dans le deuxiиme domaine catalytique, а savoir la triade Asp/Glu/Asp situйe aux positions respectives 2210/2248/2322 de la sйquence ID No. 2.
Ainsi, l'invention porte йgalement sur tout polypeptide isolй ayant une activitй catalytique de glycosylstransfйrase apte а former des dextranes ou des oligosaccharides ayant des ramifications a (1-+2) tel qu'obtenu par modification, substitution, insertion ou dйlйtion de sйquences

d'amino-acides mais comportant des sйquences prйsentant au moins 80 % et de prйfйrence au moins 90 % de similaritй avec les sйquences suivantes de la sйquence ID No. 2 : 423-439 2120-2138 478-501 2161-2184 519-539 2202-2214 560-571 2243-2250 631-645 2315-2322 1014-1021 2689-2696

De faзon prйfйrйe, enfin, un polypeptide а activitй catalytique selon l'invention contient les acides aminйs suivants :

W en positions 425 et 2122,

E en positions 430,565 et 2127,2248,

D en positions 487,489, 527,638, 2170,2172, 2210 et

2322,

H en position 637 et 2321,



Q en position 1019 et 2694.
Les polypeptides а activitй de glycosyltransfйrases aptes а former des liaisons osidiques a (1-2) peuvent se prйsenter sous forme isolйe, ou au contraire intйgrйs dans une protйine plus large, comme par exemple une protйine de fusion. Il peut кtre en effet avantageux d'inclure des sйquences prйsentant une autre fonction, comme par exemple une sйquence йtiquette spйcifique d'un ligand permettant d'en faciliter la purification. Ces sйquences йtiquettes peuvent кtre du type GST (glutathion-S-Transfйrase), Intйine - CBD (Chitine-Binding Domaine), (commercialisй par New England Biolabs, http : //www. neb. com), MBD (Maltose Binding Domain), polypeptides contenant des rйsidus histidine contigus permettant de faciliter la purification du polypeptide avec lequel il est fusionnй. L'homme du mйtier peut concevoir toute autre protйine de fusion permettant d'associer la fonction de la DSR-E de l'invention avec

une autre fonction, comme par exemple, et sans кtre limitatif, une sйquence augmentant la stabilitй de l'enzyme produite par expression dans un hфte recombinant ou une sйquence apte а augmenter la spйcificitй ou l'efficacitй d'action de cette enzyme, ou une sйquence visant а associer une autre activitй enzymatique connexe.


De telles protйines de fusion font йgalement partie de l'invention dиs lors qu'elles contiennent le domaine CD2 et le site de liaison au glucane. De la mкme faзon, les fragments de la sйquence ID No. 2, comprenant au moins la sйquence ID No. 1 et le domaine de liaison au glucane, seuls ou intйgrйs dans une sйquence polypeptidique plus large font partie de l'invention, а partir du moment oщ l'activitй enzymatique de dextrane-saccharase est conservйe.
Les variants des sйquences polypeptidiques dйfinies cidessus font йgalement partie de l'invention. Outre les polypeptides obtenus par substitution conservative des acides aminйs telle que dйfinie plus haut, les variants incluent des polypeptides dont l'activitй enzymatique est amйliorйe par exemple par mutagenиse dirigйe ou alйatoire, par йvolution molйculaire, ou par duplication du domaine catalytique CD2.
La structure particuliиre de cette enzyme identifiйe dans la prйsente invention rйsulte d'un processus comprenant :
a) l'identification et l'isolement de la dextrane-saccharase de L. mesenteroides catalysant la production des GOS d'intйrкt portant les ramifications a (1-2) ; b) le sйquenзage de fragments de l'enzyme ; c) la synthиse d'amorces d'amplification aptes а amplifier le gиne correspondant de la souche productrice ou des fragments de ceux-ci ; d) le sйquenзage des fragments amplifiйs ; e) le clonage dans des vecteurs spйcifiques et leur expression dans des hфtes appropriйs.
Les modalitйs du procйdй mis en oeuvre sont dйtaillйes dans la partie expйrimentale ci-aprиs. La premiиre йtape consiste en une

sйparation des protйines par йlectrophorиse en gel de polyacrylamide, et identification des bandes prйsentant l'activitй de dextrane saccharase par une rйaction enzymatique in situ en prйsence de substrat et d'accepteur. La nature des GOS synthйtisйs est ensuite identifiйe sur chaque bande par analyse HPLC selon les mйthodes dйcrites dans (1). Le temps de rйtention des oligosides en HPLC dйpend de la nature et de l'organisation de leurs liaisons osidiques. Il est possible en particulier de distinguer ceux constituйs de rйsidus liйs en a (1-6), en a (1-6) avec une ramification a (12) а l'extrйmitй non rйductrice de la molйcule, et ceux recherchйs composйs d'une chaоne linйaire a (1#6) avec des ramifications a (1- > 2).

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